對氧磷酶1 Q192R基因多態(tài)性與2型糖尿病合并牙周病的相關(guān)性

杜蔚蓮宋莉戴芳朱德星

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探討江西漢族人群對氧磷酶1(PON1)Q192R基因多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)合并牙周病的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA直接測序技術(shù)，檢測64例正常人(N組)、61例單純T2DM(DM組)患者、64例T2DM合并牙周病患者(DM+P組)PON1 Q192R基因型。分析江西地區(qū)漢族人群PON1 Q192R基因型和等位基因的分布特點(diǎn)，以及T2DM和T2DM合并牙周病的危險(xiǎn)因素。結(jié)果①3組間臨床資料比較：與N組比較，DM、DM+P組研究對象的平均年齡均顯著偏高；DM組的體重指數(shù)(BMI)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、收縮壓(SBP)平均水平高于N組，而高密度脂蛋白(HDL)平均水平低于N組；DM+P組的TC、TG、FPG、HbA1c、SBP平均水平高于N組，而HDL平均水平低于N組(P<0.05)。與DM組相比，DM+P組平均年齡約高7歲，SBP平均水平和吸煙率均高于DM組(P<0.05)。②3組內(nèi)不同性別臨床資料比較：N組女性的TG平均水平和吸煙率低于男性(P<0.05)；DM組女性的HDL平均水平高于男性，而吸煙率低于男性(P<0.05)；DM+P組女性的BMI、HbA1c平均水平均低于男性(P<0.05)。③PON1 Q192R基因多態(tài)性TT、CC、TC基因型頻率和T、C等位基因頻率在3組之間兩兩比較，P值均>0.05。④在N組和DM組的二分類Logistic回歸分析中，年齡、TG、TCH、SBP的OR值均>1，為發(fā)生DM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；在DM組和DM+P組的二分類Logistic回歸分析中，年齡、SBP和BMI的OR值均>1，而BMI的OR值<1，提示年齡和SBP是發(fā)生T2DM合并牙周病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而BMI則有保護(hù)作用(以α=0.05為納入標(biāo)準(zhǔn)，以α=0.1為剔除標(biāo)準(zhǔn))。結(jié)論①在其他因素存在的情況下，PON1 Q192R基因多態(tài)性不能作為T2DM合并牙周病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。②高年齡、高TG、高TC、高SBP是T2DM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；高年齡、高SBP是T2DM合并牙周病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而BMI則是保護(hù)因素。

關(guān)鍵詞〔〕對氧磷酶1；基因多態(tài)性；糖尿病；牙周病

中圖分類號〔〕R587〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：宋莉(1969-)，女，碩士生導(dǎo)師，主要從事牙周病與全身性疾病關(guān)系的研究。

第一作者：杜蔚蓮(1987-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事牙周病與全身性疾病關(guān)系的研究。

牙周病屬于口腔感染性疾病，是糖尿病(DM)的并發(fā)癥之一〔1〕，其發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素等多因素共同作用的結(jié)果。DM和牙周病互相影響、互為因果〔2〕。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激與DM關(guān)系非常密切，氧化應(yīng)激不僅在DM的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用，還可以引起DM其他大血管、微血管并發(fā)癥〔3,4〕。對氧磷酶(PON)是重要的抗氧化劑酶，是內(nèi)源性自由基清除劑，在氧化應(yīng)激中起重要作用。近年來，Altuner等〔5〕,Ergun等〔6〕通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，PON1活性及其Q192R與M55L的基因多態(tài)性與DM及其并發(fā)癥相關(guān)，且Q192R多態(tài)性相關(guān)性更大。由于基因具有種屬差異性等等原因，國內(nèi)外研究結(jié)果存在爭議。其中有關(guān)中國人PON1基因Q192R多態(tài)性與DM合并牙周病的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。本研究旨在應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)探討PON1基因Q192R多態(tài)性與2型DM(T2DM)合并牙周炎的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對象隨機(jī)選取我國江西地區(qū)漢族人189例，其中男92例，女97例。年齡24~82〔平均(51.59±16.14)〕歲。其中正常對照組(N組)64例(DNA組)、單純T2DM組(DM組) 61例、T2DM合并牙周病組(DM+P組) 64例。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)所有研究對象3個(gè)月內(nèi)均未使用抗生素，1年內(nèi)未接受牙周治療，全口至少有16顆可以進(jìn)行牙周評價(jià)的牙齒，至少有4顆磨牙，婦女無妊娠，均為長期居住在江西地區(qū)的漢族人口，且受試者在試驗(yàn)前均簽署知情同意書。

1.2.1N組納入標(biāo)準(zhǔn)選取在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢科經(jīng)相關(guān)檢查除外DM病、牙周病、冠心病及其他代謝相關(guān)疾病的表觀健康人64例(N組)，其中男28例，女36例，年齡24~78〔平均(37.66±14.49)〕歲。受試者全口牙的PD≤3 mm,平均CAL≤0.5 mm，無鄰面部位CAL≥3 mm，缺失牙不超過2顆，沒有任何冠狀動脈疾病、高血壓、脂代謝紊亂及家族DM、心血管疾病史。

1.2.2DM組納入標(biāo)準(zhǔn)選取南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科于2010年11月至2011年11月之間新近診斷T2DM的患者61例(DM組)，其中男28例，女33例，年齡26~79〔平均(54.86±12.68)〕歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L和(或)糖耐量試驗(yàn)2 h血糖(OGT 2 h PG)≥11.1 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他嚴(yán)重全身性疾病及DM并發(fā)癥；②有呼吸、消化、泌尿、生殖系統(tǒng)或身體其他部位的炎癥感染；③牙周病患者；④全身狀況較差，不能配合臨床口腔狀況檢查者；⑤近期糖尿病狀況及用藥量有明顯變化；⑥非T2DM者。

1.2.3DM+P組納入標(biāo)準(zhǔn)選擇2010年11月至2011年11月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科因DM住院的患者64例(DM+P組)，男36例，女28例，年齡40~82〔平均(62.39±9.41)歲〕。受試者患有T2DM的同時(shí)有明顯的菌斑、牙石及局部刺激因素，且與牙周組織的炎癥和破壞程度一致，病情進(jìn)展緩慢，也可間有快速進(jìn)展的活動期；無明顯錯(cuò)合畸形或不良修復(fù)體等局部刺激因素，不吸煙，排除侵襲性牙周炎。根據(jù)受試者牙周炎程度，選擇中重度牙周炎患者，參照Armitage等〔8〕推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)，口內(nèi)平均(AL)≥1.6 mm，至少3個(gè)區(qū)或至少6顆牙的鄰面部位AL≥3 mm，缺失牙數(shù)4~14顆(第3磨牙拔除、正畸牙拔除、外傷脫落牙、大面積齲失牙及先天缺牙除外)。

1.3主要儀器和試劑電泳儀、PCR儀、全自動凝膠成像分析系統(tǒng)、電熱恒溫水浴箱、漩渦振蕩器、臺式大容量高速離心機(jī)、超純水系統(tǒng)、微量分光光度計(jì)。血液基因組小量提取試劑盒、溴乙啶(EB)(10 mg/ml)、Biowest瓊脂糖、TaqDNA聚合酶2xMaster Mix、DM2000Ladder marker、Tris、冰醋酸、EDTA、無水乙醇。引物序列如下：正義引物5′-TATTGTTGCTGTGGGACCTG-3′反義引物5′-AGAGTTCACATACTTGCCATCG-3′(由南京金斯瑞生物科技公司合成)。

1.4研究方法

1.4.1樣本一般特征及臨床資料收集每位研究對象的詳細(xì)臨床資料，包括：性別、年齡、民族、出生地、體重指數(shù)(BMI)、心率(HR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、FPG、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、吸煙與否。

1.4.2DNA的提取取受試者前臂靜脈血2 ml，-70℃保存。采用DNA提取試劑盒提取外周血總基因組DNA，-20℃保存。

1.4.3DNA純度鑒定及含量的測定提取的DNA溶液用NanoPhotometer Pearl微量分光光度計(jì)在260 nm、280 nm處測量其吸光度，記錄A260/A280比值和DNA濃度。經(jīng)微量分光光度計(jì)檢測，若A260/A280值在1.8左右，說明提取的基因組DNA純度較高。

1.4.4PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為50 μl，包括：SinoBio2×MasterMix25 μl,10 μmol/L上下游引物各1 μl,10 ng/μl DNA模板2.5 μl，加ddH2O至50 μl。經(jīng)梯度PCR儀進(jìn)行退火溫度梯度擴(kuò)增，尋找最佳反應(yīng)條件，終設(shè)定退火溫度為61℃。

1.4.5瓊脂糖凝膠電泳取PCR產(chǎn)物5 μl，用1.5%瓊脂糖凝膠(含溴乙啶)電泳，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4.6PCR產(chǎn)物純化及序列測定PCR產(chǎn)物的純化和序列由南京金斯瑞公司完成。測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件讀取分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析基因型和等位基因及其頻率的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用HaploviewVersion 4.2軟件進(jìn)行分析。采用Excel2007和SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、χ2檢驗(yàn)，相關(guān)疾病危險(xiǎn)因素分析采用二分類Logistic回歸分析，計(jì)算其相對風(fēng)險(xiǎn)度比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)。

2結(jié)果

2.1PON1 Q192R多態(tài)性基因型判定PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后紫外燈投照下觀察結(jié)果，可見片段長度為205 bp的條帶，見圖1。PCR產(chǎn)物的純化和序列測序由南京金斯瑞公司完成。測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件讀取分析，測序結(jié)果如圖2。

M為DM2000 Ladder marker，1~6：PCR產(chǎn)物，7為陰性對照 圖1　PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2　PON1 Q192R基因多態(tài)性PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

2.2不同組間一般臨床資料比較3組研究對象之間的臨床資料比較見表1。DM、DM+P組研究對象的平均年齡均顯著高于N組，DM組的BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、SBP平均水平高于N組，而HDL平均水平低于N組；DM+P組的TC、TG、FPG、HbA1c、SBP平均水平高于N組，而HDL平均水平低于N組(P<0.05)。DM+P組與DM組相比，平均年齡約高7歲,SBP平均水平和吸煙率高于DM組(P<0.05)。

2.3不同組PON1 Q192R基因多態(tài)性頻數(shù)分布比較經(jīng)Haploview軟件分析，不同組人群PON1 Q192R均符合基因多態(tài)性分布情況Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。N組、DM組、DM+P組都以TC基因型為主，等位基因頻率都以C為主。PON1 Q192R基因多態(tài)性的3種基因型分布在N組與DM組之間(χ2=0.622，P=0.733)，N組與DM+P組之間(χ2=1.633，P=0.442)及DM與DM+P組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.219，P=0.200)。見表2。

表1　各組研究對象一般情況比較 ± s)

與N組比較：1)P<0.05，與DM組比較：2)P<0.05

表2　各組PON1 Q192R基因多態(tài)性基因型分布和

2.4DM合并牙周病危險(xiǎn)因素的二分類Logistic回歸分析將N組和DM組研究對象進(jìn)行二分類Logistic回歸分析，將是否患有DM作為因變量Y(0=否，1=是)，其他各項(xiàng)指標(biāo)作為自變量(X)，分析結(jié)果如下：高年齡、高TG、高TC、高SBP是本組研究對象發(fā)生DM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。將DM組和DM+P組研究對象進(jìn)行二分類Logistic回歸分析，將是否患有DM合并牙周病作為因變量Y(0=否，1=是)，其他各項(xiàng)指標(biāo)作為自變量(X)，分析結(jié)果如下：高年齡、高SBP是本研究對象發(fā)生DM合并牙周病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而BMI則有保護(hù)作用。見表4。

表3　DM危險(xiǎn)因素二分類Logistic回歸分析

表4　DM合并牙周病危險(xiǎn)因素二分類Logistic回歸分析

3討論

PON是重要的抗氧化劑酶，具有抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)過多的氧自由基，維持體內(nèi)氧化還原的動態(tài)平衡，在氧化應(yīng)激中起重要作用。許多研究認(rèn)為PON活性降低是導(dǎo)致DM慢性并發(fā)癥(DCC)的主要原因之一。國外有研究表明PON1 Q192R與L55M的多態(tài)性與DM及其并發(fā)癥相關(guān)，且PON1 Q192R多態(tài)性相關(guān)性更大〔9〕。

在PON1 編碼區(qū)的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)Q192R和M55L中， Q55L由于跟PON1啟動子區(qū)相關(guān)聯(lián)，其多態(tài)性主要決定了PON1的濃度〔10〕，而Q192R在很大程度上影響著PON1的活性〔11,12〕。PON1 Q192R多態(tài)性、基因環(huán)境和(或)基因相互作用，三者決定了不同人群不同個(gè)體血清中PON1的活性的不同〔13〕。具有較高氧化應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn)的DM患者，具有更高的血管性疾病及其他并發(fā)癥的并發(fā)率。在DM患者中有過多的氧化產(chǎn)物可能是由于慢性高血糖，高胰島素血癥，升高游離脂肪酸(FFA)和血脂異?！?4〕，其活性的降低不是由于合成減少，而是由于PON1蛋白的糖基化〔15〕。Mackness等〔16〕指出PON1活性降低以及PON1R和L位點(diǎn)的基因多態(tài)性與T2DM發(fā)生有直接的關(guān)系。Altuner等〔5〕通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，PON1 Q192R與Q55L的多態(tài)性與糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)，且與Q192R多態(tài)性相關(guān)性更大。目前為止，尚未見報(bào)道PON1 Q192R基因多態(tài)性與DM合并牙周病的關(guān)系。本次研究評價(jià)了江西地區(qū)漢族人群PON1 Q192R基因多態(tài)性與DM合并牙周病的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)二者之間存在明顯的關(guān)聯(lián)性。

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〔2013-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)