肝康樂對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

李鳳袁靜王玉鳳

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽合肥230038)

摘要〔〕目的探討中藥復(fù)方肝康樂對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法通過給小鼠腹腔注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺復(fù)制免疫功能低下的動(dòng)物模型，然后灌胃給予肝康樂高、中、低劑量，1次/d，連續(xù)10 d，分別測定小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)，巨噬細(xì)胞的吞噬功能以及溶血素水平；二硝基氯苯誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)，觀察肝康樂對(duì)DTH的影響。結(jié)果肝康樂能夠顯著提高免疫低下小鼠的碳粒廓清率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和血清溶血素水平，增強(qiáng)免疫低下小鼠的DTH。結(jié)論肝康樂煎劑可以增強(qiáng)免疫低下小鼠的免疫功能。

關(guān)鍵詞〔〕肝康樂；特異性免疫；非特異性免疫

中圖分類號(hào)〔〕R575〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：安徽省教育廳自然科學(xué)基金(No.2006KJ096C)；安徽中醫(yī)學(xué)院校自然科學(xué)基金(No.2012qn009)

第一作者：李鳳(1978-)，女，碩士，講師，主要從事中藥復(fù)方藥理與臨床研究。

肝康樂是根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合現(xiàn)代藥理研究成果創(chuàng)立的方劑，該方精選了黃芪、黨參、丹參、鱉甲、赤芍、柴胡、甘草等中藥，用來治療多種慢性肝臟疾病及肝纖維化。經(jīng)臨床實(shí)踐證實(shí)，其對(duì)多種慢性肝臟疾病的防治具有較好療效。我們前期實(shí)驗(yàn)曾以復(fù)方鱉甲軟肝片作為對(duì)照，結(jié)果證實(shí)肝康樂對(duì)免疫損傷性肝纖維化有一定的防治作用〔1〕。本文探討肝康樂對(duì)免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物昆明種小鼠(清潔級(jí))，雌雄兼用，體質(zhì)量18~22 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):皖醫(yī)實(shí)動(dòng)字第009號(hào)。豚鼠：購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥物肝康樂復(fù)方中各飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部提供，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室教師鑒定。諸藥水煎煮，3次水煎液混合后濃縮至1、2 g/ml，加苯甲酸鈉防腐，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑和儀器環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20091002)，印度墨汁(上海長江日用黏合材料廠)，綿羊紅細(xì)胞(安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心提供)。2,4二硝基氯苯(上海試劑一廠生產(chǎn)),UV757CRT紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。4000B型冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(碳粒廓清法)〔2，3〕：取小鼠50只，隨機(jī)分為五組，分別為正常組、模型組、肝康樂大、中、小劑量組，每組10只。正常組及模型組給予生理鹽水(20 ml/kg)灌胃，肝康樂大、中、小劑量組(49.14，24.57，12.28 g/kg)分別以20 ml/kg不同濃度灌胃，每天1次，連續(xù)10 d；從第5天起，除正常組外，每鼠每天腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，每天1次，連續(xù)3 d；第10天，末次給藥30 min后，每只小鼠尾靜脈注射按1∶4稀釋的印度墨汁(0.1 ml/10 g)，注射印度墨汁后2、10 min分別從眼眶后靜脈叢取血于玻片上，用微量移液器汲取20 μl血液，吹打入2 ml0.1%Na2CO3溶液，以正常小鼠血加入2 ml 0.1%Na2CO3溶液為空白對(duì)照；紫外分光分光光度計(jì)650 nm處比色，測定光密度(OD)。小鼠脫頸椎處死，稱取體重、肝、脾質(zhì)量。分別代入以下公式計(jì)算碳粒廓清指數(shù)k和吞噬指數(shù)α。

1.5免疫器官重量的測定小鼠分組、復(fù)制模型及給藥同1.4，末次給藥30 min后，脫頸椎處死小鼠，稱取體重和肝、脾重量，以每小鼠脾重(mg)/體重(g)和胸腺重(mg)/體重(g)作為脾臟和胸腺指數(shù)。

1.6小鼠血清溶血素生成的測定〔3〕小鼠按1.4分組，復(fù)制模型及給藥，從第4天起，每只小鼠腹腔注射綿羊紅細(xì)胞懸液0.2 ml致敏，致敏6 d后，即第10天，眼眶后靜脈叢取血，放血的試管置4℃冰箱過夜，離心，收集血清作800倍稀釋后，吸取0.5 ml稀釋的血清放入另一試管中，依次加入10%SRBC、補(bǔ)體(豚鼠血清)、生理鹽水各0.5 ml，空白管用生理鹽水代替血清，混勻，置37℃水浴30 min后，離心，取上清液，分光光度計(jì)540 nm處比色，測OD值；代入以下公式計(jì)算血清溶血素含量，HC50=樣本稀釋血清的OD值×稀釋倍數(shù)。

1.7對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響小鼠按1.4分組，復(fù)制模型及給藥，給藥10 d。參考文獻(xiàn)〔4〕復(fù)制DTH模型，實(shí)驗(yàn)第2天用8%的氟化鈉給小鼠腹部脫毛(3 cm×3 cm)，第3天每只小鼠腹部涂抹1%的二硝基氯苯(DNCB)丙酮麻油(丙酮∶麻油=1∶1)溶液20 μl，第6天，同法再次致敏一次，第9天每只小鼠右耳涂抹新鮮配制的1%的DNCB丙酮麻油溶液20 μl進(jìn)行攻擊，24 h后，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8 mm打孔器打下圓耳片，稱重，左右耳片之差為腫脹度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行SNK方法。

2結(jié)果

2.1肝康樂對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響與正常組比較，模型組小鼠的碳粒廓清指數(shù)k值和吞噬指數(shù)α值明顯降低(P<0.01)，提示環(huán)磷酰胺已引起小鼠免疫力低下；肝康樂大、中、小劑量組小鼠的α、k值均較模型組顯著升高(P均<0.05)，但與正常組比較仍然偏低(P<0.01)，表明肝康樂均能提高免疫低下小鼠的免疫功能，但不能使之恢復(fù)至正常。見表1。

表1　肝康樂對(duì)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞

與正常組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01，下表同

2.2肝康樂對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響模型組小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)較正常組明顯降低(P<0.01)，肝康樂各劑量組脾臟及胸腺指數(shù)較模型組顯著升高(P<0.05)，脾臟指數(shù)接近正常組(P>0.05)，表明肝康樂可顯著提高免疫低下小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)，其中，對(duì)脾臟的減重恢復(fù)較快。 見表2。

表2　肝康樂對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響 ± s, n=10)

2.3肝康樂對(duì)免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響模型組與正常組比較，小鼠血清HC50明顯降低(

表3　肝康樂對(duì)免疫低下小鼠血清溶

2.4肝康樂對(duì)免疫低下小鼠DTH的影響在DNCB所致的DTH中,模型組小鼠耳腫脹程度較正常組明顯減輕(P<0.01)，肝康樂三個(gè)劑量組都能不同程度地增加DNCB致敏后的小鼠耳廓腫脹度(P<0.05),增強(qiáng)免疫低下小鼠的DTH。見表3。

3討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜、平衡、有機(jī)的統(tǒng)一整體，具有嚴(yán)密的調(diào)控機(jī)制。免疫防御、自穩(wěn)和監(jiān)視功能構(gòu)成了機(jī)體抵抗外來病原侵襲和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制〔5〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)機(jī)體免疫功能進(jìn)行評(píng)價(jià)主要通過觀察對(duì)機(jī)體非特異性免疫功能和特異性免疫功能的影響，其中對(duì)特異性免疫功能的影響又包括對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的影響。當(dāng)病原體侵入人體時(shí)，病原體首先被巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞識(shí)別、殺傷，巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞在執(zhí)行功能時(shí)，無嚴(yán)格的選擇性，因此它們介導(dǎo)的免疫反應(yīng)被稱為非特異性免疫。Kupffer細(xì)胞是肝臟的巨噬細(xì)胞〔6〕。本研究以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下模型，觀察肝康樂對(duì)免疫功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肝康樂各劑量組可明顯提高免疫低下小鼠的碳粒廓清指數(shù)k值和吞噬指數(shù)α值，大劑量可使k值恢復(fù)接近正常組，但不能使α值恢復(fù)到正常范圍內(nèi)。各劑量組可使免疫低下小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著升高，可使脾臟指數(shù)恢復(fù)接近正常，使機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能受到保護(hù)；并且可顯著提高免疫低下小鼠血清溶血素水平，使其恢復(fù)接近正常水平，提示肝康樂可提高免疫低下小鼠體液免疫功能。DTH是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的一種類型， T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的DTH的強(qiáng)弱是反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的敏感指標(biāo)之一。肝康樂各劑量組均能夠增強(qiáng)DNCB誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng),肝康樂具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的能力。肝康樂能增強(qiáng)免疫低下機(jī)體的免疫功能，使機(jī)體抗病能力有所增強(qiáng)，這一作用可能也是肝康樂能夠防治慢性肝臟疾病和肝纖維化的機(jī)制之一。由于中藥復(fù)方作用的多層次、多靶點(diǎn)、復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，其具體作用環(huán)節(jié)及詳盡機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1李鳳，胡昊，鳳良元，等.肝康樂抗免疫損傷性肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.安徽醫(yī)藥，2009;13(1)：21-2.

2楊海燕，張黎莉.至生膠囊對(duì)小鼠免疫功能的影響及其升白作用和抗應(yīng)激能力的研究〔J〕.中成藥，2010;32(2)：293-5.

3李儀奎，王欽茂.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991：157-8.

4徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:1433-8.

5Guardia T,Rotelli AE,Juarez AO,etal. Anti-inflammatory properties of plant flavonoids. Effects of rutin,quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat〔J〕.Farmaco,2001;56(9):683-7.

6陳慰峰.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)〔M〕.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:21-40.

〔2014-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)