糖尿病大鼠肺損傷的發(fā)病機制

周蕾房輝田金莉?qū)O雪玲

(唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌二科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的觀察糖尿病(DM)大鼠肺組織的病理改變及蛋白激酶C(PKC) 、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及纖連蛋白(FN)活性的變化，探討DM大鼠肺纖維化的發(fā)病機制。方法實驗分為對照組和DM組，并于4、8 w觀察血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、體重及肺部組織病理改變，采用免疫組化方法測定PKC、TGF-β1、FN在DM大鼠肺組織表達(dá)變化。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)半定量檢測肺組織 p38MAPK mRNA的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比較DM組大鼠肺泡間隔及毛細(xì)血管壁增寬，肺間質(zhì)增加，部分肺泡腔萎縮甚至塌陷,肺組織中PKC、TGF-β1、p38 MAPK、FN表達(dá)增多、活性增強。結(jié)論鏈脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠肺組織高糖環(huán)境下引起血糖、HbA1c升高及體重減輕并引起細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)PKC-TGF-β1-p38MAPK被激活引起FN表達(dá)增多從而引起肺組織發(fā)生纖維化。

關(guān)鍵詞〔〕糖尿病(DM)；肺；蛋白激酶C；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1；p38絲裂原活化蛋白激酶；纖連蛋白

中圖分類號〔〕R587.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：房輝(1964-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌與代謝病研究。

第一作者：周蕾(1982-)， 女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌與代謝病研究。

近年國內(nèi)外研究〔1〕發(fā)現(xiàn) ,糖尿病(DM)對心、腦、腎有顯著的影響。有研究〔2〕表明肺臟也是DM損傷靶器官之一，DM本身可導(dǎo)致肺臟損害，可發(fā)展為慢性肺功能障礙〔3〕。DM患者肺功能，可以出現(xiàn)限制性通氣功能障礙和彌散、阻塞性及混合性通氣功能障礙〔4〕。本實驗通過觀察DM大鼠肺組織病理學(xué)改變及蛋白激酶C(PKC)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)- β1、纖連蛋白(FN)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的表達(dá)的變化，為DM肺損傷的防治提供客觀的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物分組與處理雄性SD大鼠50只。隨機分為對照(N)組及糖尿病模型(DM)組，DM組大鼠按60 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)溶液一次性腹腔注射，N組腹腔注射等量上述的檸檬酸緩沖液，其中20只成模，10只大鼠在飼養(yǎng)過程中因感染、酮癥等原因死亡，剔除出本試驗，72 h后尾靜脈采血測定空腹血糖(FPG)及定性尿糖，F(xiàn)PG≥16.7 mmol/L，尿糖定性≥，動物多飲、多食和尿量增加者確定為DM模型。每組于造模后4、8 w進(jìn)行指標(biāo)檢測與觀察。

1.2標(biāo)本的收集與處理在禁食12 h后，取大鼠尾末梢毛細(xì)血管全血測定FPG。天平稱重大鼠體重(BW)。均為1次/w。殺檢前1 d空腹尾靜脈取血測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。取上述各組大鼠肺組織行病理學(xué)檢查及免疫組化實驗。

1.3免疫組化肺組織PKC、TGF-β1、FN表達(dá)及p38MAPK mRNA表達(dá)免疫組化法檢測肺組織PKC、TGF-β1、FN免疫組化法檢測表達(dá)。一抗分別為兔抗鼠PKC、兔抗大鼠TGF -β1、兔抗大鼠FN，二抗為羊抗兔。采用捷達(dá)JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件，選取染色陽性區(qū)域進(jìn)行計算圖像半定量掃描分析。RT-PCR檢測大鼠肺組織p38MAPK mRNA的表達(dá)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2．1各組血糖、HbA1c及BW變化在4、8 w同一時間點，DM組與N組FPG、HbA1c、BW比較有顯著差別(P<0.01)。而兩組不同時間點之間比較，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明在不同病程DM組大鼠均維持在高血糖狀態(tài)。見表1。

表1　實驗動物血糖、HbA1c及

與N組比較：1)P< 0.05；下表同

2.2肺組織病理學(xué)變化與N組比較，DM組HE染色結(jié)果顯示肺泡間隔及毛細(xì)血管基底膜增厚，肺間質(zhì)增加，部分肺泡腔萎縮甚至塌陷，見圖1。

圖1　4、8 w各組肺組織病理學(xué)變化(HE，×40)

2.3免疫組化結(jié)果PKC、TGF-β1、FN表達(dá)于肺間質(zhì)及血管上皮細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)，在肺間質(zhì)中呈間斷不連續(xù)分布。N組4、8 w時PKC、TGF-β1、FN蛋白平均光密度值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而DM組4、8 w時PKC、TGF-β1、FN表達(dá)的平均光密度值均高于同期N組。不同病程DM組比較，PKC、TGF-β1、FN蛋白表達(dá)逐漸增高(P<0.01)。見表2，圖2。

表2　實驗動物PKC、TGF-β1、FN蛋白表達(dá)結(jié)果

圖34、8 w各組肺組織PKC、TGF-β1、FN表達(dá)(DAB，×40)

2.4在各組肺組織p38MAPK mRNA表達(dá) 與同期N組比較，DM組8 w p38MAPK mRNA表達(dá)增高1.68倍(P<0.05),見圖3。

1~4:N組4 w、N組8 w、DM組4 w、DM組8 w 圖3　p38-MAPK mRNA在肺組織中的表達(dá)

3討論

DM患者基底膜增厚可達(dá) 500～800 nm,其基底膜增厚主要涉及肺泡上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜，可導(dǎo)致肺泡腔縮小〔5〕，肺毛細(xì)血管流量下降〔6〕。有關(guān)研究〔7〕證實 ,高糖狀態(tài)下PKC系統(tǒng)參與DM并發(fā)癥的病理生理過程。PKC主要以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，以活性形式結(jié)合于細(xì)胞膜。PKC的活化有多條途徑，最主要的途徑是接受外來信息后產(chǎn)生二酰甘油(DAG)，DAG再活化PKC。PKC細(xì)胞外調(diào)控蛋白激酶通過激活源癌基因復(fù)合物c-fos/c-jun二聚體，引起活性蛋白(AP)-1的激活，而AP-1位于TGF-β1基因起動子中。可見PKC激活可引起TGF-β1分泌增加。另外，AP-1還能激活位于纖維黏連素基因啟動子區(qū)域的環(huán)腺苷酸(cAMP)反應(yīng)原件，從而增強纖維黏連素的表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)成分增多。有研究顯示報道,TGF-β1通過活化 p38MAPK誘導(dǎo)鼠腎小球系膜細(xì)胞的前膠原Ⅰ的合成,提示p38MAPK在 TGF-β1 誘導(dǎo)的ECM合成中起重要作用。ECM重要成分FN的含量增多是促使肺臟纖維化和硬化進(jìn)行性發(fā)展的一個重要因素。FN在細(xì)胞增殖和ECM的產(chǎn)生和積聚中發(fā)揮重要作用〔8〕。在病理過程中它可以促使成纖維細(xì)胞增生并產(chǎn)生更多的ECM，而增多的FN又在各種生長因子的作用下，細(xì)胞肥大和纖維細(xì)胞增生，這個過程持續(xù)發(fā)展，ECM不成比例的過度積聚，膠原含量增加，最終導(dǎo)致肺組織纖維化〔9〕。本實驗結(jié)果提示在早期DM肺損傷過程中PKC蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。高血糖狀態(tài)下PKC引起TGF-β的激活?；罨腡GF-β1使p38MAPK進(jìn)一步磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因表達(dá)。刺激肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌的FN的表達(dá)量明顯增加,從而引起DM肺間質(zhì)成纖維ECM過度分泌，這一過程導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-10-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)