聯(lián)合水蛭注射液后處理對腦缺血損傷大鼠磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)的影響

胡躍強(qiáng)唐農(nóng)1吳林1孫淑榮梁妮易燦輝1

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西南寧530023)

摘要〔〕目的觀察缺血后處理(IPOC)聯(lián)合水蛭注射液后處理對腦缺血損傷大鼠磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(p-eNOS) mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。方法SD大鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、缺血再灌注對照組(MCAO組)、IPOC組、IPOC+水蛭注射液后處理組(P-L組)四組。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)模型及IPOC模型，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡技術(shù)檢測p-eNOS mRNA及其蛋白表達(dá)變化。結(jié)果SO組有少量p-eNOS mRNA及其蛋白表達(dá)；MCAO組大鼠腦缺血再灌注24 h缺血半暗帶p-eNOS表達(dá)較SO組明顯增高(P<0.05)；IPOC組二者的表達(dá)水平較MCAO組明顯升高(P<0.05,P<0.01)；P-L組能較IPOC組進(jìn)一步升高其表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論腦IPOC可能通過誘導(dǎo)p-eNOS的表達(dá)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，水蛭注射液后處理可進(jìn)一步促進(jìn)其表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕缺血后處理；水蛭注射液；磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶

中圖分類號〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFAA053075);廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)課題(重2012046)

通訊作者：唐農(nóng)(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事缺血性腦血管病研究。

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)

第一作者：胡躍強(qiáng)(1973-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事缺血性腦血管病研究。

缺血后處理(IPOC)是近年發(fā)現(xiàn)的重要內(nèi)源性腦保護(hù)機(jī)制，因其能減輕腦缺血/再灌注(I/R)損傷而引起廣泛關(guān)注〔1〕，并已成功地應(yīng)用于臨床〔2〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Akt/eNOS)信號途徑參與了I/R損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)〔3〕。相對于IPOC手段，藥物后處理簡便易行，因此更具有應(yīng)用前景。水蛭注射液經(jīng)臨床研究證實(shí)對腦卒中先兆和腦梗死急性期有確切治療作用的中藥制劑〔4,5〕，但其后處理效應(yīng)及療效機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)通過比較IPOC和聯(lián)合水蛭注射液后處理對I/R損傷后Akt/eNOS轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路的關(guān)鍵蛋白eNOS磷酸化(p-eNOS)水平的影響，以探討二者的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1材料和方法

1.1 動物分組及處理健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±50)g，隨機(jī)將大鼠分為4組：假手術(shù)組(SO組)、缺血再灌注對照組(MCAO組)、IPOC組、IPOC+水蛭注射液后處理組(P-L組)。分別作如下處理：SO組：僅實(shí)施假手術(shù)但不進(jìn)行腦缺血操作，同時(shí)腹腔注射生理鹽水4 ml；MCAO組：實(shí)施90 min的腦缺血和24 h的再灌注，在再灌注即刻腹腔注射生理鹽水4 ml；IPOC組：在再灌注即刻自CCA內(nèi)抽出線栓30 s，然后將線栓重新置入30 s，反復(fù)進(jìn)行此操作3次后進(jìn)行再灌注24 h，并在再灌注即刻腹腔注射生理鹽水4 ml；P-L組：在IPOC組操作的基礎(chǔ)上，在再灌注即刻，腹腔注射水蛭注射液4 mg/kg。

1.2 造模方式參照Longa的線栓法建立大鼠MCAO動物模型。分離并結(jié)扎大鼠左頸外動脈遠(yuǎn)端和頸總動脈近端，將前端用火焰燒圓的尼龍線從頸總動脈殘端插入，進(jìn)線約18~20 mm，大腦中動脈缺血(MCAO)后90 min抽出線栓，完成腦缺血。然后參照文獻(xiàn)〔6〕行缺血后處理，即在再灌注即刻自CCA內(nèi)抽出尼龍線栓30 s，然后將線栓重新置入30 s，反復(fù)進(jìn)行此操作3次后進(jìn)行再灌注24 h。

1.3 藥物制備水蛭選用菲牛蛭，又稱廣西菲牛蛭。采用稀醇滲漉提取，再經(jīng)跨熱處理法制得水蛭注射液，每支2 ml，每毫升含生藥1 g，由本院制劑室制備。

1.4 主要試劑兔抗大鼠p-eNOS (Ser1177)多克隆抗體(Santa Cruz)，耦聯(lián)有辣根過氧化物(HRP)羊抗兔IgG二抗(博士德公司)，內(nèi)參GAPDH(康成生物公司)，總RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)，PCR反應(yīng)試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，引物及內(nèi)參均由大連寶生物有限公司提供。

1.5 缺血半暗帶腦皮質(zhì)p-eNOS mRNA表達(dá)測定①大腦組織總RNA提?。簠⒖糡rizol試劑盒說明書提取總mRNA；②引物合成：熒光定量RT-PCR所用p-eNOS和GAPDH引物序列如下：p-eNOS正義：5′- GGGCCAGGGTGATGAGCTCTG-3′；反義：5′-CCCTCCTGGCTTCCAGTGTCC -3′；產(chǎn)物長度為324 bp；GAPDH正義5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′；反義5′-GTGGAAGAATGGGAGTT GCTGT-3′，產(chǎn)物長度610 bp；③比較兩基因擴(kuò)增效率：選取cDNA樣品模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，p-eNOS與GAPDH分別進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，得出熒光曲線，通過cDNA濃度梯度的log值對ΔCT值作圖比較兩基因擴(kuò)增效率；④反應(yīng)體系及條件：兩種基因同管擴(kuò)增，反應(yīng)體系均為10 μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 5 μl ，cDNA模板1.0 μl、兩種基因上下游引物(10 pmol/μl)各0.4 μl、探針(10 pmol/μl)各0.4 μl，加無RNA酶的水至3.2 μl。在DNA Engine OpticonTM2 連續(xù)熒光檢測系統(tǒng)(MJ Research公司)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，58.2℃ 20 s，62.0℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)，4℃保存。每例樣品及陰性對照均設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，取均值。

1.6 缺血半暗帶腦皮質(zhì)內(nèi)p-eNOS蛋白表達(dá)測定缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg，冰上研磨組織后加預(yù)冷的蛋白裂解液，繼續(xù)碾磨至液態(tài)，然后4℃，14 000 r/min 離心15 min，提取上清液，取20 μl用 BCA法進(jìn)行蛋白定量測定，所剩上清液配一致蛋白濃度，并按4∶1的比例加上樣，各樣本提取等量總蛋白(60 μg)，經(jīng)100℃ 5 min變性后，采用10%SDS-PAGE進(jìn)行垂直電泳進(jìn)行分離，電泳后將凝膠上的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行免疫反應(yīng)。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h ，然后依次加入兔抗p-eNOS抗體，37℃孵育2 h，4℃過夜；耦聯(lián)有辣根過氧化物(HRP)羊抗兔IgG 室溫孵育2 h。Beyo ECL Plus超敏發(fā)光液中X-感光盒內(nèi)曝光。以上反應(yīng)均在塑料袋內(nèi)進(jìn)行，其間用TBST充分洗滌。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，采用Alpha Ease FC軟件進(jìn)行圖像分析，獲取各組Western印跡條帶的平均光密度(OD)值，內(nèi)參為GAPDH，目的蛋白與內(nèi)參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0行單因素方差分析及LDS-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 p-eNOS mRNA表達(dá)變化SO組有少量p-eNOS mRNA表達(dá)；MCAO組大鼠腦缺血再灌注24 h缺血半暗帶p-eNOS mRNA表達(dá)較SO組明顯增高(P<0.05)；IPOC組其表達(dá)水平較MCAO組明顯升高(P<0.01)；P-L組能較IPOC組進(jìn)一步升高其表達(dá)(P<0.05)。見表1。

2.2 p-eNOS蛋白表達(dá)的變化SO組有少量蛋白表達(dá)(0.814±0.057)；MCAO組缺血半暗帶p-eNOS蛋白表達(dá)較SO組明顯增高(1.066±0.065,P<0.05)；IPOC組其表達(dá)水平較MCAO組明顯升高(1.248±0.083，P<0.05)；P-L組能較IPOC組進(jìn)一步升高其表達(dá)(1.512±0.133，P<0.01，圖1)。

表1　各組p-eNOS mRNA相對量的表達(dá)變化

與SO組比較：1)P<0.05；與MCAO組比較：2)P<0.01；與IPOC組比較：3)P<0.05

圖1　各組大鼠p-eNOS蛋白的表達(dá)

3討論

IPOC是指長時(shí)間缺血后，于再灌注前短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)短暫的再灌和停灌，可明顯減輕缺血組織和器官的再灌注損傷。最近研究顯示Akt/eNOS通路在I/R損傷的保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用〔3,7〕，該通路是細(xì)胞內(nèi)重要的腦保護(hù)防御機(jī)制之一，上調(diào)此信號通路可對抗多種凋亡基因的表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。但該通路是否參與了IPOC的保護(hù)機(jī)制鮮見報(bào)道。eNOS是Akt的重要下游底物之一，也是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，活化的Akt與eNOS結(jié)合后，誘導(dǎo)eNOS向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，磷酸化其N端的Ser活性位點(diǎn)而使eNOS失活，從而阻滯其對下游蛋白的磷酸化阻止凋亡發(fā)生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

藥物后處理是指在長時(shí)間缺血后,于再灌注前或再灌注開始的幾分鐘內(nèi)用藥,通過藥物干預(yù)來減輕器官的再灌注損傷。其保護(hù)作用機(jī)制與IPOC相似,但藥物后處理更具有臨床應(yīng)用價(jià)值,為器官再灌注損傷的治療提供了新策略。目前已證實(shí)，藥理學(xué)刺激亦能通過外源性機(jī)制誘發(fā)后處理現(xiàn)象，即能夠進(jìn)一步增強(qiáng)IPOC的器官保護(hù)作用〔8,9〕。但是，目前的藥物后處理主要是局限在吸入麻醉藥物，如異氟烷和七氟烷等，即所謂的“麻醉藥物后處理”〔10〕。而中藥以其療效明顯、副作用小、多靶點(diǎn)的作用途徑而成為IPOC研究的熱點(diǎn)。水蛭是廣西的優(yōu)勢中藥品種，我院自上世紀(jì)90年代開始對水蛭進(jìn)行臨床藥理學(xué)研究，在國內(nèi)率先對其劑型進(jìn)行改良制成水蛭注射液，經(jīng)臨床及動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)它對腦缺血損傷具有良好的治療作用〔4,5,11,12〕。但聯(lián)合水蛭注射液后處理尚未涉及神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域，是一個(gè)嶄新的研究方向。本結(jié)果提示聯(lián)合2種后處理方式有協(xié)同作用效果。

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〔2013-12-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)