表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性

袁選舉陳萍王賢和鄧守恒

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心,湖北十堰442000)

摘要〔〕目的觀察表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)體外增強(qiáng)紫杉醇對(duì)食管癌CaEs-17細(xì)胞化療敏感性的作用，探討可能的作用機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、紫杉醇組(培養(yǎng)液中紫杉醇終濃度為360 nmol/L)，EGCG組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L)、聯(lián)合組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L，紫杉醇濃度為360 nmol/L)，各組作用24 h，CCK-8法和細(xì)胞克隆形成法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率和存活率，金氏公式評(píng)價(jià)二藥的協(xié)同效果；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及周期分布；Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力；免疫印跡法檢測(cè)P21蛋白表達(dá)水平。結(jié)果EGCG、紫杉醇均可抑制CaEs-17細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞存活率和侵襲力；減少S期細(xì)胞數(shù)量、阻斷細(xì)胞周期于G1期，并能上調(diào)P21蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，二藥聯(lián)用上述作用效果更為顯著(P<0.01)。結(jié)論EGCG能夠增強(qiáng)紫杉醇對(duì)食管癌CaEs-17細(xì)胞的化療敏感性，這種作用部分是通過(guò)上調(diào)P21蛋白實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞〔〕食管癌;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；紫杉醇；化療

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R735.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金(2008CDZ022)

通訊作者：鄧守恒(1973-)，男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤藥理研究。

第一作者：袁選舉(1969-)，男,碩士,主治醫(yī)師,主要從事腫瘤放化療治療研究。

Effect of epigallocatechin-3-gallate enhancing chemotherapy sensitivity of taxol on human Esophageal Cancer Line CaEs-17 in vitro

YUAN Xuan-Ju,CHEN Ping,WANG Xian-He,etal.

Center of Oncology,People Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) enhancing chemotherapy sensitivity of taxol on human esophageal cancer Line CaEs-17 in vitro and explore its possible mechanism.MethodsThere were four groups:control,EGCG (CaEs-17 cells were pretreated by 20 mg/L EGCG),Taxol (CaEs-17 cells were pretreated by 360 nmol/L Taxol) and EGCG /Tazol groups (CaEs-17cells were pretreated by 360 nmol/L Taxol and 20 mg/L EGCG).After treatment for 24 h,the growth and proliferation of CaEs-17 cell were detected by CCK-8 assay and clone formation test and Jin′s formula was used to assess the synergistic effects between two drugs.Cell apoptosis and phase were detected by the flow cytometry.Cell invasive ability was measured with Transwell.The expression of P21 protein was detected by Western blot.ResultsEGCG,Taxol alone inhibited cell proliferation,induced cell apoptosis,decreased cell survival rate and invasive ability,increased G1 phase cells and down-regulated the expression of P21 in CaEs-17 cells(P<0.05).The effect of Taxol combination with EGCG was better than that of Taxol,EGCG alone(P<0.01).ConclusionsEGCG could enhance chemotherapy sensitivity of taxol on human esophageal cancer Line CaEs-17 in vitro,which is partly related to the up-regulation of P21 protein on tumor cells.

【Key words】Esophageal Cancer;Epigallocatechin-3-Gallate；Taxol;Chemotherapy

紫杉醇作為食管癌常用的化療藥物之一，主要通過(guò)促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用〔1〕，然而，骨髓抑制及近年來(lái)出現(xiàn)的多藥耐藥等毒副作用限制了其最大療效的發(fā)揮。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是綠茶中含量最高，活性最強(qiáng)的單體〔2〕，已有的研究表明，EGCG可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式對(duì)人鼻咽癌、肺癌、胃腺癌、前列腺癌、大腸癌及白血病等細(xì)胞產(chǎn)生明顯的殺傷作用〔3〕。王江江等〔4〕研究還發(fā)現(xiàn)，EGCG與一些化療藥物聯(lián)用尚能顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，顯示其具有良好的應(yīng)用前景。EGCG能否增強(qiáng)紫杉醇對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷作用尚未見(jiàn)有人報(bào)道。

1材料與方法

1.1 試藥試劑與儀器EGCG、碘化丙啶(PI)、甲基纖維素(CPS4000)為美國(guó)Sigma產(chǎn)品；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司； Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司；兔抗人P21單抗及山羊抗兔的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝分析純。Mod 550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Mini-Prote電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)；Epics Elite ESP型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)食管癌細(xì)胞株CaEs-17購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)，每2~3 d用0.25%胰酶消化，1∶2傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合給藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響取指數(shù)生長(zhǎng)期CaEs-17細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于96孔板，37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后吸出原培養(yǎng)液，分為4組，即EGCG組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L)、紫杉醇組(培養(yǎng)液中紫杉醇終濃度為360 nmol/L)、聯(lián)合組(培養(yǎng)液中EGCG終濃度為20 mg/L，紫杉醇濃度為360 nmol/L)，另設(shè)空白對(duì)照組(只加入RPMI1640培養(yǎng)基，未給予其他任何處理),EGCG和紫杉醇取1/2 IC50值，紫杉醇IC50值參照文獻(xiàn)〔5〕，EGCG IC50值參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去上清液，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD)值，代入公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD度)/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3 流式法檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡細(xì)胞分組及處理同1.2.2，收集各組作用24 h細(xì)胞，0.01 mol/L PBS0.5 ml重懸細(xì)胞，加70%乙醇1 ml，-20℃固定24 h，加入PI (終濃度為50 μl/ml)和RNA酶(終濃度為0.25 mg/ml)，室溫下避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀作DNA分析，以ModFit LT軟件分析，擬合計(jì)算各時(shí)相細(xì)胞的百分比。

1.2.4 克隆形成法檢測(cè)細(xì)胞增殖〔5，6〕參照文獻(xiàn)配制半固體培養(yǎng)基，收集經(jīng)EGCG、紫杉醇單獨(dú)和聯(lián)合作用24 h的各組細(xì)胞， PBS洗去藥物，離心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成7.0×103個(gè)/ml單細(xì)胞懸液,于24孔板預(yù)加1.2%甲基纖維素培養(yǎng)基1.0 ml/孔，加入單細(xì)胞懸液50 μl，使每孔細(xì)胞數(shù)為350個(gè),每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，混勻后置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12～14 d后于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率(給藥組平均克隆數(shù)/未給藥組平均克隆數(shù)×100%),實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 Transwell法分析細(xì)胞侵襲性改變細(xì)胞分組及處理同1.2.2，參照試劑盒說(shuō)明，以NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)液做趨化液，在Transwell上室內(nèi)加入100 μl不含小牛血清的RPMI1640，37℃孵育1 h，加入上述各組細(xì)胞懸液20 μl(調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)/ml),每組4個(gè)復(fù)孔。37℃ 12 h后取出濾膜，甲醇固定，HE染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)濾膜外表面的細(xì)胞數(shù)，每張濾膜隨機(jī)取5個(gè)視野(×200)取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，以相對(duì)侵襲抑制率表示腫瘤細(xì)胞的侵襲力，相對(duì)侵襲抑制率(%)=(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組×100%。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)P21蛋白表達(dá)細(xì)胞分組及處理同1.2.2，收集細(xì)胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，依次加入P21蛋白一抗和二抗，加入底物液顯色，拍照。蛋白條帶用Quanti Scan軟件進(jìn)行密度掃描分析。

2結(jié)果

2.1 單獨(dú)和聯(lián)合給藥對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用EGCG和紫杉醇單獨(dú)作用CaEs-17細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的增殖抑制率分別為37.5%±2.2%和40.7%±2.8%,二藥合用，則抑制率升高至73.8%±3.8%，合用產(chǎn)生抑制率大于兩藥單獨(dú)使用(q=1.16),表明兩藥合用產(chǎn)生的抑制作用遠(yuǎn)大于兩藥單獨(dú)相加，產(chǎn)生協(xié)同效果。

2.2 單獨(dú)和聯(lián)合給藥對(duì)細(xì)胞周期分布、凋亡率的影響EGCG和紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合作用CaEs-17細(xì)胞24 h,均可明顯降低S期細(xì)胞比例，升高G0-G1期細(xì)胞比例，細(xì)胞被阻滯于G0-G1期，尤其以聯(lián)合用藥組作用效果更為明顯(P<0.01) 。二藥單獨(dú)或聯(lián)合均可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，二藥聯(lián)用效果更為顯著(P=0.004、0.001、0.000)(表1)。

2.3 單獨(dú)和聯(lián)合給藥對(duì)細(xì)胞存活率及侵襲力的影響EGCG和紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合作用CaEs-17細(xì)胞24 h均可明顯抑制細(xì)胞克隆形成，使細(xì)胞存活率顯著下降,尤其以二藥合用效果更為顯著(P=0.061、0.056、0.007)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)也顯示出相似的作用結(jié)果，表現(xiàn)為與空白對(duì)照組比較，經(jīng)EGCG和紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合作用后的食管癌細(xì)胞穿過(guò)基底膜的數(shù)量大大降低，二藥合用后效果更為明顯(P=0.084、0.071、0.005)。見(jiàn)表2。

表1　EGCG與紫杉醇單獨(dú)和合用對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡和

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

表2　EGCG與紫杉醇單獨(dú)和合用對(duì)食管癌細(xì)胞

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4 單獨(dú)和聯(lián)合給藥對(duì)細(xì)胞P21蛋白表達(dá)的影響免疫印跡及灰度掃描結(jié)果顯示， 未經(jīng)處理的空白對(duì)照CaEs-17細(xì)胞內(nèi)P21蛋白呈低表達(dá)(灰度值為0.301 2±0.09)。經(jīng)EGCG和紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)P21蛋白灰度值分別升至(0.924 5±0.18)、(0.521 6±0.17)和(1.205 9±0.27),上調(diào)率分別為(206.83±21.17)%、(83.21±10.23)%、和(294.36±19.82)%，與空白對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P=0.000、0.001、0.000)(圖1)。

1，2，3，4分別為EGCG+紫杉醇組、EGCG組、紫杉醇組、空白對(duì)照組 圖1　EGCG與紫杉醇單獨(dú)和合用對(duì)食管癌 細(xì)胞P21蛋白表達(dá)的影響

3討論

綠茶是我國(guó)及東南亞一帶的傳統(tǒng)飲品，綠茶中的主要成分EGCG具有顯著的清除氧自由基、抗氧化、抗衰老、防紫外線(xiàn)、預(yù)防心血管疾病等功效〔3〕。近年來(lái)，EGCG的抗腫瘤作用逐漸引起了人們的重視，大量體內(nèi)外試驗(yàn)表明，EGCG可通過(guò)多種途徑對(duì)人體多種腫瘤產(chǎn)生明顯的抑制增殖作用，有望開(kāi)發(fā)成一種新的抗腫瘤藥物〔8~10〕。

目前對(duì)EGCG抗腫瘤作用的研究多集中在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤血管生成等方面，而對(duì)于EGCG聯(lián)合常用化療藥物可否提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性及降低化療藥物毒副作用等方面的研究卻較少。本文將EGCG聯(lián)合紫杉醇作用于體外培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞株CaEs-17，采用CCK-8法和克隆形成法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG、紫杉醇均可明顯抑制細(xì)胞增殖，合用還可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，抑制效果大于二藥相加。由于克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞的增殖能力，故而從本結(jié)果中還可看出， EGCG聯(lián)合紫杉醇不僅可對(duì)處于增殖期的細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，還可明顯抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖，這比單純殺死或者抑制癌細(xì)胞本身具有更大的價(jià)值〔11〕。

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞增殖失控有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究采用流式細(xì)胞法檢測(cè)了經(jīng)EGCG、紫杉醇單獨(dú)和聯(lián)合作用后的細(xì)胞凋亡率并對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行了擬合，結(jié)果顯示，二藥單獨(dú)或聯(lián)用均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1期，合用上述效果更為顯著。由于細(xì)胞增殖的速度主要取決于細(xì)胞周期的長(zhǎng)短，而細(xì)胞周期的長(zhǎng)短又主要取決于G1期，G1期阻滯可使細(xì)胞增殖周期延長(zhǎng)，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡〔12〕。

侵襲是惡性腫瘤的主要特征之一，也是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因之一。本研究結(jié)果顯示，EGCG、紫杉醇均可對(duì)食管癌細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生明顯的抑制作用，二藥合用，抑制效果更加顯著，提示EGCG聯(lián)合紫杉醇尚能起到降低紫杉醇單藥化療后食管癌細(xì)胞易出現(xiàn)的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等作用。

P21基因是目前已知具有最廣泛活性的細(xì)胞周期抑制基因，可對(duì)細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡以及損傷修復(fù)等過(guò)程產(chǎn)生影響〔13〕。研究表明，P21的表達(dá)缺失可引起腫瘤的生長(zhǎng)失控、更差的分化和預(yù)后等，而導(dǎo)入外源P21基因后，上述現(xiàn)象又可得到有效抑制〔14〕。本文經(jīng)EGCG、紫杉醇單獨(dú)和聯(lián)合作用后的食管癌細(xì)胞中P21蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，表明這兩種藥物合用可能就是通過(guò)激活P21通路來(lái)發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻止細(xì)胞侵襲等藥理作用的，但具體的分子機(jī)制傷仍需進(jìn)行深入研究。

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〔2013-12-29修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)