卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與腦出血的關(guān)系

戴繽李海燕1胡志強(qiáng)黃輝朱廣通孟國路2萬偉慶2

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京100050)

摘要〔〕目的探討卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)基因511C/T多態(tài)性與漢族人群腦出血的關(guān)系。方法選擇2012年6月至2013年10月該院收治的原發(fā)性腦出血患者102例，健康對(duì)照120例。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和DNA測(cè)序法檢測(cè)LCAT 511C/T基因多態(tài)性。采用氧化酶法檢測(cè)受試者血脂水平。結(jié)果腦出血組CT基因型頻率為6.87%，對(duì)照組為1.67%，腦出血組T等位基因頻率為3.43%，對(duì)照組為0.83%，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。511CC組總膽固醇(TC)水平明顯低于511CT組，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平升高(t=2.524，P=0.013；t=1.871，P=0.049)。在腦出血組中，511CC組HDL-C水平明顯高于511CT亞組(t=1.954，P=0.047)。結(jié)論LCAT基因511C/T多態(tài)性與腦出血無關(guān)，而T等位基因與HDL-C代謝有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶；腦出血；基因多態(tài)性；高密度脂蛋白膽固醇

中圖分類號(hào)〔〕R743〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院院級(jí)青年基金(2010-Q06)

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇醫(yī)院神經(jīng)外科

第一作者：戴繽(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科疾病診治研究。

血脂代謝異常尤其是高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低，導(dǎo)致膽固醇在動(dòng)脈壁沉積、血管粥樣硬化，是腦出血的重要致病因素〔1，2〕。卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)是HDL-C代謝的關(guān)鍵酶，遺傳性LCAT缺陷癥、LCAT基因突變均會(huì)影響LCAT的表達(dá)、分泌及代謝，進(jìn)而影響機(jī)體HDL-C水平〔3〕。LCAT是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的易感基因之一〔4〕，在動(dòng)物模型中能誘發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、腦出血等AS相關(guān)疾病〔5〕，但目前LCAT多態(tài)性與心血管事件發(fā)生的相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議〔6〕。本研究通過對(duì)腦出血患者進(jìn)行LCAT基因511C/T多態(tài)性檢測(cè)，探究LCAT基因多態(tài)性與腦出血的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年6月至2013年10月我院收治的腦出血患者102例，男67例，女35例，平均年齡(61.7±1.9)歲，體重指數(shù)(BMI)(23.5±1.2)kg/m2；既往吸煙史26例，飲酒史18例，高血壓史102例，糖尿病史6例。所有患者經(jīng)MRI或CT確診，排除心源性栓塞、梗死后出血、腫瘤、血液病、腦血管畸形、動(dòng)脈瘤、淀粉樣腦血管病、藥物引起的腦卒中、冠心病患者以及入組前3個(gè)月曾服用影響血脂水平藥物的患者。選取同期于我院接受體檢的健康對(duì)照組120例，男74例，女46例，平均年齡(60.1±1.5)，BMI(24.3±1.9)kg/m2;既往吸煙史19例，飲酒史12例，高血壓史17例，糖尿病史5例。兩組性別、年齡、BMI、生活方式、糖尿病等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但腦出血組患者伴有高血壓的比例顯著高于對(duì)照組(P=0.002)。所有研究對(duì)象均為漢族。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2血脂測(cè)定取受試者靜脈血10 ml，5 ml用于血脂測(cè)定，5 ml用于DNA制備(加枸櫞酸鈉抗凝)。所有受試者取血前均常規(guī)禁食12 h。

采用氧化酶法測(cè)定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、HDL-C水平，計(jì)算低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，公式為LDL=TC-(HDL-C)-(TG/5)。采用免疫比濁法測(cè)定載脂蛋白(apo)A-I及apoB100。

1.3DNA制備采用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA。將靜脈血置于離心管(50 ml)中，加25 ml的1倍紅細(xì)胞裂解緩沖液，混勻后置于4℃冰箱30 min。液體透明后離心10 min(3 000 r/min)，留管底白細(xì)胞層。依次加入3 ml核裂解液，150 μl 20%SDS溶液以及20 μl 20 mg/ml蛋白酶K溶液，充分混勻后于37℃恒溫?fù)u床過夜。次日加入3 ml飽和重蒸酚，充分搖勻10 min，離心10 min(3 000 r/min)，取上清液至無菌15 ml離心管中。加入30 ml無水乙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后可見白色絮狀物析出。取干凈玻璃鉤經(jīng)火焰滅菌冷卻后鉤出上述白色絮狀物，70%乙醇沖洗2次，室溫下干燥2~3 min，置于500 μl的1倍TE中溶解，室溫放置過夜后-70℃冰箱保存。

1.4聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物根據(jù)基因組序列(NT10478)用Primer3軟件設(shè)計(jì)，且用GCG軟件行BLAST對(duì)比。引物序列：正義5′-GTACCTGGACAGCAGCAA-3′，反義5′-GTAGGCGTCTCTGTGAGTA-3′。選用PE4800型PCR反應(yīng)儀進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸5 min。采用凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物特異性。

1.5單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)取5 μl特異性好的PCR產(chǎn)物，加入5 μl的2倍變性緩沖液，混勻后99℃變性10 min，置于冰上5 min，將變性產(chǎn)物迅速上樣至含5%甘油的80 g/L丙烯酰胺凝膠(49∶1)，恒溫電泳后銀染。

1.6DNA序列分析選取有異常條帶的LCAT基因511C/T陽性標(biāo)本進(jìn)行DNA正向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank和SNP數(shù)據(jù)庫比較分析，測(cè)序由上海英駿公司完成。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件?；蛐偷腍ardy-Weinberg平衡(HWE)吻合度采用HWE軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1基因型分布經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，對(duì)照組LCAT基因511C/T位點(diǎn)基因型符合HWE(P>0.05)，樣本具有群體代表性。腦出血組與對(duì)照組CT基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.240，P=0.620)，兩組T等位基因頻率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.529，P=0.117)。見表1。

2.2不同基因型亞組間血脂水平比較511CC組TC水平明顯低于511CT組(t=2.524，P=0.013)，HDL-C水平明顯高于511CT組(t=1.871，P=0.049)，其他血脂水平兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。腦出血組511CC亞組HDL-C水平明顯高于511CT亞組(t=1.954，P=0.047)，而其他血脂水平兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2 。因?qū)φ战MCT基因組樣本例數(shù)過少，未做511C/T多態(tài)性與血脂水平關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1　兩組LCAT基因511C/T基因頻率和

表2　511CC型和511CT型亞組間血脂水平比較

3討論

遺傳因素在腦出血發(fā)生中起重要作用，易感基因除直接誘發(fā)腦出血，還通過影響動(dòng)脈粥樣硬化而間接發(fā)揮作用，成為腦出血遺傳機(jī)制研究的熱點(diǎn)。LCAT作為HDL-C代謝的關(guān)鍵酶，能夠水解血漿中氧化的LDL，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)LDL的吞噬作用，防止其生成泡沫細(xì)胞，拮抗AS形成過程〔7〕。Holleboom等〔8〕檢測(cè)低HDL-C的病人LCAT位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)29%的病人攜帶有突變位點(diǎn)，而Pan等〔9〕對(duì)亞洲人群的研究也發(fā)現(xiàn)LCAT位點(diǎn)突變與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和血脂紊亂有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，LCAT基因511C/T多態(tài)性可能與我國漢族人群腦出血無關(guān)。朱曉巖等〔10〕對(duì)我國漢族人群LCAT多態(tài)性與家族聚集性腦出血的關(guān)系研究結(jié)果顯示，LCAT基因608C/T、511C/T多態(tài)性與我國漢族人群腦出血發(fā)病無關(guān)，但與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死有關(guān)。這與我們的研究結(jié)果相符，可能的原因：①原發(fā)性腦出血的主要病因?yàn)楦哐獕骸?1，12〕，動(dòng)脈粥樣硬化雖在腦出血中起重要作用，但仍受其他相關(guān)因素影響；②LCAT基因突變率相對(duì)較低；③LCAT約有10個(gè)功能性位點(diǎn)突變，511C/T位點(diǎn)突變可能與其他位點(diǎn)存在連鎖關(guān)系，需多位點(diǎn)聯(lián)合分析其作用。LCAT基因型亞組與血脂水平關(guān)系分析結(jié)果顯示，LCAT與HDL-C代謝水平有關(guān)，而HDL-C能夠?qū)⒕奘杉?xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，并通過代謝排出體外，降低膽固醇水平，因而LCAT可能間接影響TC水平。Agirbasli等〔13〕在土耳其進(jìn)行的大規(guī)模人群LCAT基因多態(tài)性與血脂水平關(guān)系分析結(jié)果顯示，LCAT多位點(diǎn)突變均與TC、HDL-C水平密切相關(guān)，且以4886C/T位點(diǎn)突變最常見。Naseri等〔14〕對(duì)歐洲人群的研究也發(fā)現(xiàn)LCAT基因多態(tài)性與HDL-C水平有關(guān)，這與我們的研究結(jié)果一致。但LCAT不同位點(diǎn)突變對(duì)TC、HDL-C水平影響不同，因而511C/T位點(diǎn)突變需結(jié)合其他位點(diǎn)進(jìn)行多位點(diǎn)綜合分析。總之，本研究結(jié)果顯示LCAT基因多態(tài)性與腦出血發(fā)生率無關(guān)，但與HDL-C水平密切相關(guān)，提示LCAT基因多態(tài)性是HDL-C代謝的重要生物學(xué)指標(biāo)。

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〔2014-01-17修回〕

(編輯徐杰)