李永敏，沈 茂

（臺州學(xué)院實驗室與設(shè)備管理處，浙江 臨海 317000）

基于葉酸受體介導(dǎo)的磁性熒光靶向納米探針的制備及其性能研究

李永敏，沈 茂

（臺州學(xué)院實驗室與設(shè)備管理處，浙江 臨海 317000）

擬采用一步溶劑熱法先制備出帶有無定型碳層包覆的磁性Fe3O4納米粒子；然后通過靜電結(jié)合法，將巰基丙酸修飾的水溶性CdTe量子點組裝到其表面；為了使所制備的磁性探針具有較好的穩(wěn)定性和生物相容性，通過Stober法在納米粒子最外層包裹上生物相容性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的帶有胺基修飾的二氧化硅殼層；最后與葉酸(FA)進行耦合，制得具有磁性和熒光的雙功能靶向納米探針。分別利用熒光光譜，傅里葉變換紅外光譜（FTIR），X射線衍射（XRD），掃描電鏡（SEM），透射電子顯微鏡（TEM）和振動樣品磁強計（VSM）等對所制備的磁性熒光復(fù)合納米粒子的形態(tài)、大小、化學(xué)成分及磁性能進行表征。實驗結(jié)果表明：所得產(chǎn)物粒徑大小約200 nm，磁化強度約21.9 emu·g-1，仍然保持有較強的熒光性能，在生物成像方面具有潛在的應(yīng)用價值。

葉酸；CdTe量子點；Fe3O4納米顆粒；溶劑熱；熒光

近幾年來，功能納米生物材料以其多樣性和特殊性正越來越多地引起各國研究者的關(guān)注。其中，半導(dǎo)體熒光量子點作為一種由II-VI 族(CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, HgSe)或III-V族(InP, InAs)元素組成的納米顆粒，可以簡單地通過改變粒徑尺寸大小來調(diào)節(jié)其熒光發(fā)射峰的波長，從而獲得連續(xù)的激發(fā)光譜。同時，與傳統(tǒng)的有機熒光染料不同，量子點的激發(fā)光譜寬，同一種類不同尺寸大小的量子點可以由單一波長的光源激發(fā)。而且，半導(dǎo)體熒光量子點還具有高量子產(chǎn)率、較窄的發(fā)射光譜半高寬及較強的抗光漂白性等一系列優(yōu)異的光學(xué)特性。因此，將量子點作為熒光標記物已成為近年來國內(nèi)外的研究熱點，已有不少文獻報道量子點被成功應(yīng)用于細胞標記、免疫熒光檢測和活體成像[1-5]。另一方面，以四氧化三鐵為代表的磁性納米材料由于具有超順磁性和高飽和磁化強度，在生物醫(yī)用診斷、治療等領(lǐng)域具有重要的研究價值[6-8]。經(jīng)過表面修飾后的磁性納米顆粒能與特定的細胞、蛋白、DNA等發(fā)生偶聯(lián)，通過外加磁場作用即可實現(xiàn)對這些特定的生物分子的分離和標定[9-11]。

然而，單一功能化的納米材料在實際應(yīng)用中不可避免地會受到一定限制。如果將量子點和磁性納米顆粒復(fù)合，就可以同時完成對特定生物分子的熒光標記和磁性分離。而且，具熒光可示蹤性、磁響應(yīng)性和表面功能性的熒光雙重功能的納米材料，在靶向藥物載體、細胞的分離和標識、磁共振成像以及生物傳感器等眾多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[12-15]。

受體介導(dǎo)的腫瘤靶向成像就是以腫瘤細胞表面特異性或過度表達的受體為靶點，以受體對應(yīng)的配體或配體結(jié)合物為載體，利用受體和配體的特異性反應(yīng)，將靶向探針遞送至受體表達陽性腫瘤細胞的一種成像系統(tǒng)。探針既可以是放射性核素，也可以是熒光物質(zhì)，該成像技術(shù)可增強探針的選擇性，成為腫瘤生物標記的研究熱點。作為介導(dǎo)細胞內(nèi)化的特異性受體之一，葉酸受體（FR）能夠?qū)⑷~酸及其復(fù)合物攝取入真核細胞胞漿由于FR在部分人體腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌和腎細胞癌等細胞表面都有過量表達，而在正常組織的表達又高度保守，因此利用FR進行腫瘤特異性顯像和治療也受到廣泛關(guān)注[16]。

本研究擬采用一步溶劑熱法，先制備出無定型碳包覆的磁性 Fe3O4納米粒子；然后通過靜電吸附法，將巰基丙酸修飾的 CdTe熒光納米粒子組裝到其表面；為了使所制備的探針具有較好的穩(wěn)定性和生物相容性，通過Stober法在磁性納米粒子最外層包裹上生物相容性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的胺基修飾的二氧化硅殼層；最后再與葉酸(FA)進行耦合，制得具有磁性和熒光的雙功能靶向復(fù)合納米探針, 其制備示意圖如圖1所示。

圖1 葉酸受體介導(dǎo)的磁性熒光靶向納米探針的制備示意圖Fig. 1 The preparation procedure of the Fe3O4@C-CdTe@SiO2-FA microspheres

1 實驗部分

1.1 實驗藥品及儀器

二茂鐵，二氧化碲（TeO2），CdCl2?2H2O，巰基丙酸（MPA），正硅酸乙酯（TEOS）等化學(xué)試劑均為分析純，購自上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；葉酸（FA）購自上?；菖d生化試劑有限公司；傅里葉變換紅外光譜（Nicolet，美國熱電公司），X射線衍射（Dmax-2500，Rigaku公司），掃描電鏡（S-4800，Hitachi 公司），透射電子顯微鏡（TEM-2100，Jeol公司），振動樣品磁強計（7407，Lake Shore 公司）。實驗用水為超純水。

1.2 Fe3O4@C 微球的制備[17]

稱取1.2 g二茂鐵溶于40 mL 丙酮中，超聲分散使其完全溶解，然后將2 mL過氧化氫加到上述混合液中，磁力攪拌30 min。接著將混合液轉(zhuǎn)移至100 mL的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，加熱到200 ℃后保溫反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻到室溫，將沉淀物用丙酮多次洗滌，舍棄上層清液，最后將黑色的產(chǎn)物在真空爐干燥，備用。

1.3 水溶性CdTe量子點的合成[18]

以二氧化碲作為碲源，3-巰基丙酸作還原劑制備水溶性CdTe。分別稱取2 mmol CdCl2·2.5H2O溶解于100 mL蒸餾水中，在電動攪拌下加入5.4 mmol MPA；然后再用0.1 mol/L NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)至9.0，最后加入0.5 mmol TeO2。混合液前驅(qū)體置于超聲微波反應(yīng)系統(tǒng)中加熱回流3.5 h，得到紅色熒光的CdTe量子點。

1.4 Fe3O4@C-CdTe 復(fù)合納米粒子的合成

稱取0.1g Fe3O4@C納米粒子，超聲分散于含有100 mL二次蒸餾水的三口燒瓶中，在電動攪拌下加入10 mL PDDA溶液（5 mg/mL），繼續(xù)攪拌30 min后，再向三口燒瓶中加入10 mL CdTe量子點，反應(yīng)8 h后磁性分離，用蒸餾水把未吸附的CdTe量子點清洗掉，得到層層自組裝的 Fe3O4@C-CdTe復(fù)合納米粒子。磁鐵分離清洗。最后置于50 ℃真空干燥箱中干燥，備用。

1.5 Fe3O4@C-CdTe @SiO2-NH2微球的合成

取0.1 g Fe3O4@C-CdTe超聲分散在20 mL二次蒸餾水和80 mL乙醇混合溶劑中。然后將混合液轉(zhuǎn)移到250 mL三口燒瓶中，加1 mL 25%氨溶液和0.1 mL TEOS，室溫攪拌6 h后，用磁鐵分離，再用水和乙醇交替洗滌多次。將上述樣品分散在 100 mL乙醇中，并加入2.0 mL APTES，在氮氣保護條件下回流12 h后，得到Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2。用乙醇反復(fù)洗滌，磁鐵分離。置于50 ℃真空干燥箱中干燥，保存。

1.6 Fe3O4@C-CdTe@SiO2-FA微球的合成

稱取50 mg Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2超聲分散到含有0.1 g FA、50 mg NHS和60 mg EDC的100 mL DMSO溶液中，然后轉(zhuǎn)入到150 mL的三口燒瓶中攪拌24 h。最后將所得產(chǎn)物磁性分離后用無水乙醇洗滌多次，最后置于50 ℃真空干燥箱中干燥，保存。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜(FTIR)分析

圖2 分別為(a) Fe3O4, (b) Fe3O4@C, (c)Fe3O4-CdTe, (d) Fe3O4-CdTe@SiO2-NH2, (e), Fe3O4-CdTe@SiO2-FA, and (f) FA的紅外譜圖Fig. 2 The FI-IR spectra of (a) Fe3O4, (b) Fe3O4@C, (c)Fe3O4-CdTe, (d) Fe3O4-CdTe@SiO2-NH2, (e),Fe3O4-CdTe@SiO2-FA, and (f) FA

圖2為純的Fe3O4、Fe3O4@C、Fe3O4@C-CdTe、Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2、Fe3O4@C -CdTe@SiO2-FA和 FA的紅外光譜圖。從圖2a-e的譜線可以看出，位于585 cm-1處均有比較強點的Fe-O鍵振動吸收峰，說明樣品中均有磁性納米Fe3O4的存在。譜線b為包覆了一層無定型碳后Fe3O4@C的紅外光譜，我們可以看出，與純的Fe3O4相比，位于2 935和 2 835 cm-1出有比較強的C-H吸收峰出現(xiàn)。譜線c為化學(xué)耦合量子點后形成 Fe3O4@C-CdTe吸收光譜，從圖中可以看出，1 559 和 1 402 cm-1處出現(xiàn)了是羧基的伸縮振動吸收峰。這是因為所制備的CdTe量子點外表面包覆了一層巰基丙酸，而帶有大量的羧基。譜線d是Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2的紅外光譜，從圖中可以看出在790, 960和1 082 cm-1出均有Si–O的特征吸收峰，同時在1 471 cm-1處也出現(xiàn)了-NH2的振動吸收峰。當 FA耦合到Fe3O4@C-CdTe@SiO2表面后，我們從與圖2e看出，在1 604 cm-1處出現(xiàn)較弱的苯的共軛雙吸收峰。由此可見，合成的雙功能微球與理論上的結(jié)構(gòu)基本一致。

2.2 SEM形貌分析

通過SEM和TEM電鏡分析可以清晰的觀察樣品制備過程中殼層的厚度、形貌、尺寸的變化。由圖3a的SEM照片可見，通過一步溶劑熱法合成的Fe3O4@C顆粒為均勻球形，粒徑分布較均勻，分散性較好，表面比較光滑，但是有少許粗糙的雜質(zhì)出現(xiàn)，可能是因為少量的二茂鐵還沒反應(yīng)完全造成，樣品的平均粒徑在150～200 nm左右。由圖3b SEM可以看出，當附著 CdTe量子點后，顆粒表面光澤度增加，且有聚電解質(zhì)PDDA和量子點結(jié)合而成的薄膜出現(xiàn)，復(fù)合物顆粒的尺寸與包覆前比較變化不明顯，因為制備出來的水溶性 CdTe量子點的粒徑只有3 nm左右[18]。當在Fe3O4@C-CdTe復(fù)合物的最外層包覆上SiO2殼層后，復(fù)合物的粒徑明顯增加，平均粒徑在180～250 nm左右，但是因為是一步法在SiO2表面進行胺基改性，所以制備出來的樣品團聚比較明顯，如圖3c-d所示。從插圖3d 的TEM照片中看出，我們可以看出SiO2殼層的厚度大約在20 nm左右。

圖3 為(a) Fe3O4@C，(b)Fe3O4@C@CdTe和(c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的SEM譜圖和(d) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的TEM譜圖Fig.3 SEM images of (a) Fe3O4@C，(b)Fe3O4@C@CdTe，(c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2and TEM images of (d) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2

2.3 XRD 和 EDS 分析

通過XRD表征，研究了磁性Fe3O4@C核、包覆CdTe量子點和SiO2殼層后復(fù)合粒子的結(jié)構(gòu)及相組成，如圖4A所示。

由圖4A(d)可見，所有衍射峰的位置和相對強度與尖晶石型Fe3O4（PDF No.19-0629）標準譜非常吻合[19]，并沒有出現(xiàn)任何雜峰，表明包覆了碳層后并沒有改變樣品的晶型結(jié)構(gòu)。由圖4A (b，c)可以看出，當Fe3O4@C外層依次包覆CdTe量子點和SiO2殼層后，復(fù)合粒子中，相對應(yīng)于尖晶石型 Fe3O4的衍射峰明顯減弱，并可以清晰地看出復(fù)合物中出現(xiàn)了與CdTe量子點標準卡片（JCPDS No. 19-0629）相對應(yīng)的特征衍射峰。另外，通過EDS電子能譜，我們對樣品元素組成做了粗略的分析，由圖4B可以看出，樣品Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2分別存在Fe、O、C、N、Cd、Te 和Si 元素。

圖4(A)為CdTe, Fe3O4@C and Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的XRD譜圖；(B)為Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的EDS譜圖Fig.4 (A) XRD patterns of CdTe, Fe3O4@C and Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2microspheres; (B) EDS dataof the as-prepared Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2microspheres

2.4 磁學(xué)性質(zhì)分析

圖5 (a) Fe3O4@C, (b) Fe3O4@C@CdTe, (c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2, (d) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-FA的VSM譜圖Fig.5 VSM patterns of (a) Fe3O4@C, (b) Fe3O4@C@CdTe, (c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2, and (d)Fe3O4@C@CdTe@SiO2-FA microspheres

圖5分別給出了Fe3O4@C、Fe3O4@C-CdTe、Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2和Fe3O4@C-CdTe@ SiO2-FA的磁滯回線圖。由圖可以看出4種樣品的飽和磁化強度分別為 76.4、60.2、30.0 和 21.9 emu·g-1。與單純的Fe3O4@C相比，包覆后磁化強度明顯降低。插圖（上）為制備的 Fe3O4@C@CdTe@ SiO2-FA樣品在可見光下拍出來的照片，圖（下）為該樣品在365 nm 紫外燈照射下拍出來的照片。表征結(jié)構(gòu)表明，此熒光復(fù)合納米仍然具有比較強的熒光。

3 結(jié) 論

先采用一步溶劑熱法簡單合成了碳包覆的磁性納米Fe3O4, 并分別通過靜電自組裝、Stober和共價結(jié)合法制備了含有熒光、SiO2殼層和葉酸靶向識別的磁性復(fù)合納米粒子。所得復(fù)合納米粒子同時具有良好的發(fā)光性和較強磁性，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒕哂袧撛诘膽?yīng)用。

［1］Sandra J.R, Jerry C.C, Oleg K, et al. Biocompatible Quantum Dots for Biological Applications[J]. Chemistry & Biology, 2011, 18 (1): 10-24.

［2］Zhang G, Shi L, Selke M, et al. CdTe quantum dots with daunorubicin induce apoptosis of multidrug-resistant human hepatoma HepG2/ADM cells: in vitro and in vivo evaluation[J]. Nanoscale Res Lett, 2011, 6(1): 418.

［3］Ge S, Zhang C, Zhu Y, et al. BSA activated CdTe quantum dot nanosensor for antimony ion detection[J]. Analyst, 2010, 135(1), 111–115.

［4］周慧睿, 陶可, 孫康. 熒光磁性納米復(fù)合顆粒的制備及展望[J]. 化學(xué)進展, 2011, 23(6): 1100-1107.

［5］王顯祥, 鐘嬌懿, 劉怡, 等. 磁性熒光雙功能納米材料的合成及其用于葡萄糖的分離檢測[J]. 化學(xué)學(xué)報, 2010, 68(20): 2063-2068.

［6］Kumar CS, Mohammad F. Magnetic nanomaterials for hyperthermiabased therapy and controlled drug delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2011, 63: 789.

［7］Jadhav S A, Bongiovanni R. Synthesis and organic functionalization approaches for magnetite (Fe3O4) nanoparticles[J]. Adv Mat Lett, 2012, 3 (5): 356-361.

［8］Ankamwar B, Lai TC, Huang JH, et al. Biocompatibility of Fe3O4nanoparticles evaluated by in vitro cytotoxicity assays using normal, glia and breast cancer cells[J]. Nanotechnology, 2010, 21: 075-102.

［9］Samanta B, Yan HH, Fischer NO, et al. Protein-passivated Fe3O4nanoparticles: low toxicity and rapid heating for thermal therapy[J]. J Mater Chem, 2008, 18: 1204-1208.

［10］Luo B, Song XJ, Zhang F, et al. Multi-Functional Thermosensitive Composite Microspheres with High Magnetic Susceptibility Based on Magnetite Colloidal Nanoparticle Clusters[J]. Langmuir, 2010, 26 (3): 1674–1679.

［11］Maity D, Zoppellaro G, Sedenkova V, et al. Surface design of core-shell superparamagnetic iron oxide nanoparticles drives record relaxivity values in functional MRI contrast agents[J]. Chem Commun, 2012, 48: 11398.

［12］Wang HG, Sun L, Li YP, et al. Layer-by-Layer assembled Fe3O4@C@CdTe core/shell microspheres as separable luminescent probe for sensitive sensing of Cu2+Ions[J]. Langmuir, 2011, 27: 11609-11615.

［13］Yang ZS. Magnetic and luminescent dual-functional SiO2beads created through controlled sol-gel process[J]. Adv Mat Lett, 2011, 2: 195-199.

［14］Xiao Q, Xiao Chong. Preparation and characterization of silica-coated magnetic–fluorescent bifunctional microspheres[J]. Nanoscale Res Lett, 2009, 4: 1078-1084.

［15］Shen JM, Guan XM, Liu XY, et al. Luminescent/Magnetic Hybrid Nanoparticles with Folate-Conjugated Peptide Composites for Tumor-Targeted Drug Delivery[J]. Bioconjugate Chem, 2012, 23: 1010-1021.

［16］趙美霞, 李洋, 王超杰. 葉酸受體靶向性的γ-環(huán)糊精-葉酸包合物修飾的CdSe/ZnS 量子點的合成及其生物活性[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2013, 48:566-572.

［17］Gan ZB, Zhao AW, Zhang MF, et al. Controlled synthesis of Au-loaded Fe3O4@C composite microspheres with superior SERS detection and atalytic degradation abilities for organic dyes[J]. Dalton Trans, 2013, 42: 8597.

［18］Shen M, Jia WP, You YJ, et al. Luminescent properties of CdTe quantum dots synthesized using 3-mercaptopropionic acid reduction of tellurium dioxide directly[J]. Nanoscale Res Lett 2013, 8: 253.

［19］Wang YF, Xu F, Zhang L, et al. One-pot solvothermal synthesis of Fe3O4-PEI composite and its further modification with Au nanoparticles[J]. J Nanopart Res, 2013, 15: 1338.

Preparation and Performance of Folate-conjugated Magnetic /Fluorescent Bifunctional Microspheres

LI Yong-min，SHENG Mao

（Laboratory and Equipment Management Office, Taizhou University, Zhejiang Linhai 317000, China）

The functional imaging properties of magnetic microspheres composed of magnetic core and CdTe quantum dots in the silica shell functionalized with folic acid (FA) were investigated. The preparation procedure included the preparation of carbon-coated Fe3O4nanoparticles (Fe3O4@C NPs) prepared by a one-pot solvothermal method, the reaction by LBL in order to obtain the Fe3O4@C-CdTe NPs, and the growth of SiO2shell vent the photoluminescence (PL) quenching via a St?ber method. Moreover, in order to have a specific targeting capacity, the magnetic and fluorescent bifunctional microspheres were synthesized by bonding of SiO2shell with folic acid (FA) molecules via amide reaction. The morphology, size, chemical component and magnetic property of as-prepared composite nanoparticles were characterized by fluorescent spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD), scanning transmission electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), and vibrating sample magnetometer (VSM)，respectively. The results show that the magnetization saturation value of Fe3O4@C-CdTe@SiO2-FA NPs is about 21.9 emu/g, the size of nanoparticles is about 200 nm, and the magnetic and fluorescent bifunctional microspheres have strong luminescent which will be employed for immuno-labeling and fluorescent imaging of HeLa cells.

Folic acid; CdTe quantum dots; Fe3O4NPs; Solvothermal; Fluorescent

R 943

A

1671-0460（2015）03-0454-04

浙江省教育廳科研項目，項目號：Y201017414。

2014-12-18

李永敏（1982-），男，浙江仙居人，實驗師，碩士，2012年畢業(yè)于浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程專業(yè)，研究方向：復(fù)合材料合成及分析。E-mail：1447792893@qq.com。