·生命科學(xué)·

尿酸酶突變體的高通量篩選方法

廖娟1,劉紅博2,高昂2,楊曉蘭2,李元麗2,廖飛2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,重慶402160;2.重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400016)

摘要：建立一種尿酸酶突變體的高通量篩選方法。將野生型苛求芽孢桿菌尿酸酶及其突變體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,每個(gè)克隆誘導(dǎo)培養(yǎng)后超聲裂解上清液為樣品,全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定293 nm光吸收,并分析反應(yīng)啟動(dòng)后8～28 min的數(shù)據(jù)計(jì)算酶活性,Bradford法測(cè)定總蛋白; ROC比較用酶活性或比活性識(shí)別陽(yáng)性突變體的可靠性。任2種突變體酶活性或比活性比值>2時(shí),ROC分析曲線下面積接近1;當(dāng)酶活性或比活性僅增加50%時(shí),分析比活性所得曲線下面積比分析酶活性更大，將ROC分析比活性提高近1倍。突變體敏感度達(dá)90%時(shí)，比活性為判斷陽(yáng)性突變體閾值,其相當(dāng)于以起始物比活性均值加1.7倍標(biāo)準(zhǔn)差;此閾值能用于高通量篩選變體庫(kù)中比活性增加1倍以上的陽(yáng)性突變體。

關(guān)鍵詞：尿酸酶;比活性;陽(yáng)性突變體;通用閾值

收稿日期：2014-10-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30672009);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(NCET-09-0928),重慶市科委重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(CSTC2011BA5039)

作者簡(jiǎn)介：廖娟,女,重慶市人，從事體外診斷與藥物篩選生物技術(shù)研究。

中圖分類號(hào)：Q55

A high-throughput method for recognizing Uricase

mutants of higher activity

LIAO Juan1, LIU Hong-bo2, GAO Ang2,YANG Xiao-lang2, LI Yuan-li2, LIAO Fei2

(1.Central Laboratory, of Yongchuan Hospital , Chongqing Medical University, Chongqing 402160, China;

2.Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostics of the Education Ministry, College of Laboratory Medicine,

Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Abstract:Using an automatic microplate reader, a high-throughput screening method was developed to recognize uricase mutants of higher activity. The expression vectors of wildtype uricase and its three mutants were used to transform Escherichia coli cells separately. After lysis of cells via ultrasonic treatment, crude enzymes in lysates served as samples to measure activity. Uricase activity was estimated by analyzing absorbance at 293 nm from 8 min to 28 min since reaction initiation. The concentrations of total protein in a lysate were determined by the Bradford assay. Uricase activity or specific activity was compared against a threshold to recognize a mutant of higher activity. The reliability of activity and specific activity for recognizing positive mutants were evaluated by Receiver-operation-curve (ROC). Any uricase mutant with> 200% improvement of activity yielded area-under-the-curve (AUC) close to 1.00. For a mutant with about 50% improvement of activity, ROC analysis of specific activity gave AUC close to 1.00 while the analysis of activity gave smaller AUC. The threshold was determined by fixing the sensitivity at 90% in ROC and expressed as the mean plus 1.7-fold standard deviation of specific activity of the starting material. A uricase mutant with>100% improvement of specific activity could be efficiently recognized as a positive candidate by the high-throughput method.

Key words: Uricase； specific activity； positive mutants； universal threshold

人體無(wú)尿酸酶,體內(nèi)嘌呤代謝終產(chǎn)物為尿酸,其主要經(jīng)腎臟排泄;體內(nèi)尿酸生成過快或腎臟排泄受阻都會(huì)造成尿酸累積,并導(dǎo)致痛風(fēng)或腫瘤融解綜合征。外源尿酸酶制劑靜脈注射給藥能清除體內(nèi)血清尿酸且?guī)缀鯚o(wú)副作用,是臨床治療尿酸積累所致難治性痛風(fēng)和腫瘤融解綜合征的有效藥物[1-4]。但長(zhǎng)期連續(xù)注射外源蛋白制劑會(huì)誘發(fā)人體產(chǎn)生抗體而降低其療效,甚至產(chǎn)生難以預(yù)計(jì)的毒副作用;新近上市的pegloticase連用兩周后就易誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體[2,4]。提高尿酸酶催化能力以降低治療劑量,從而減少/避免副作用是蛋白藥物治療應(yīng)用的關(guān)鍵[5]。此外,尿酸酶是體外診斷血清尿酸含量的關(guān)鍵工具酶,其比活性越高則應(yīng)用成本越低[6]。因此,獲得高比活性尿酸酶是其應(yīng)用于診斷和治療領(lǐng)域的關(guān)鍵。

篩選進(jìn)化生物技術(shù)建立的尿酸酶突變體庫(kù)是獲得高活性尿酸酶的有效策略,但需高通量方法快速、準(zhǔn)確地測(cè)定酶活性或比活性,以及可靠識(shí)別高活性陽(yáng)性突變體的方法。課題組所發(fā)現(xiàn)苛求芽孢桿菌尿酸酶序列已獲發(fā)明專利授權(quán),此尿酸酶有超強(qiáng)熱穩(wěn)定性,但對(duì)底物親和力低且比活性較低,需進(jìn)行分子改造以提高其應(yīng)用價(jià)值[7-8]。本文以野生型苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶及其3種突變體為模型,在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上建立高通量測(cè)定尿酸酶活性和比活性的方法,并建立識(shí)別其陽(yáng)性突變體的通用判斷閾值,為篩選尿酸酶突變體庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

光譜掃描多功能讀數(shù)儀(Thermo Scientific Varioskan Flash,賽默飛世爾科技),超聲破碎儀(JY92-Ⅱ,寧波新芝生物科技股份有限公司),96孔酶標(biāo)板(BIO basic INC),純水器(Classic UVF,法國(guó)威立雅),紫外分光光度計(jì)(TU-1810,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)均按照儀器使用手冊(cè)要求進(jìn)行操作。尿酸、牛血清白蛋白均購(gòu)買于Sigma-Aldrich?？捡R斯亮藍(lán)G250購(gòu)于上海生工。超純水18.2 MΩ·cm-1?？燎笱挎邨U菌A.T.C.C. 29604野生型胞內(nèi)尿酸酶的pET28a載體為課題組此前構(gòu)建[7]。大腸桿菌細(xì)胞株BL21(DE3)來(lái)自上海生工。4種尿酸酶突變體按活性下降順序命名為候選突變體A，B，C和D(表1,基因突變和這些突變體的表達(dá)載體構(gòu)建委托北京泰和基因有限公司完成),具體序列見此前報(bào)道[9]。

1.2尿酸酶及其突變體的重組表達(dá)、純化和活性測(cè)定

尿酸酶及其突變體的重組表達(dá)參照文獻(xiàn)[7]。將尿酸酶對(duì)應(yīng)pET28a載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中(大腸桿菌無(wú)內(nèi)源性尿酸酶);挑選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)3 h后,18℃下加入終濃度為1.0 mmol/L的異丙基-β-D-半乳糖苷在18℃誘導(dǎo)尿酸酶表達(dá)16 h。收集菌體,150 W超聲間隔2.5 s破碎2.0 min,10 000 r/min，離心10 min的上清液為細(xì)胞裂解液。各種尿酸酶突變體分別經(jīng)DEAE-纖維素離子交換層析和制備型電泳純化。在25℃用0.075 mmol/L尿酸在pH 9.2硼酸鹽緩沖液中在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定293 nm光吸收變化的初速度表示尿酸酶活性,按其摩爾消光系數(shù)11.5 (mmol/L)-1cm-1校正尿酸儲(chǔ)備液的濃度[10]。尿酸溶液每天配制,使用前在(25±0.5)℃下預(yù)熱20 min。尿酸酶反應(yīng)體系共150 μL,含尿酸溶液50 μL,加入用50.0 mmol/L的硼酸緩沖液(pH 9.2)稀釋的裂解液100 μL啟動(dòng)反應(yīng),間隔2.0或5.0 min測(cè)定293 nm光吸收變化,每份樣品測(cè)定3次。用各突變體酶活性與其總蛋白濃度之比表示比活性。每分鐘消耗1微摩爾尿酸的酶量為1單位。

1.3總蛋白測(cè)定

用牛血清白蛋白為參考,用Bradford法測(cè)定尿酸酶樣品中的蛋白濃度[11]。硼酸緩沖液稀釋裂解液8倍,反應(yīng)體系共150 μL,尿酸酶溶液50 μL,考馬斯亮藍(lán)溶液100 μL,振蕩10 min后檢測(cè)595 nm光吸收。

1.4尿酸酶突變體的模擬篩選

在模擬篩選過程中所用4種尿酸酶同此前報(bào)道[9];這4種尿酸酶純化后任兩種尿酸酶活性比值在1.3～4.0倍間。每種尿酸酶突變體pET28a載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,平板篩選30個(gè)陽(yáng)性克隆;每個(gè)克隆分別轉(zhuǎn)移到含1.0 mL選擇性液體培養(yǎng)基的5.0 mL Ependorf 管中,37℃放大培養(yǎng)3 h;加入異丙基-β-D-半乳糖苷到終濃度為1.0 mmol/L,在18℃ 誘導(dǎo)表達(dá)16 h;離心收集濾渣洗滌,加50 mmol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液0.20 mL,冰浴超聲裂解,離心后上清液為裂解液樣品用于測(cè)定突變體酶活性。

1.5數(shù)據(jù)分析及尿酸酶陽(yáng)性突變體的識(shí)別

用Microsoft Excel計(jì)算均值(χ)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)、變異系數(shù)(CV)。用SPSS 17.0進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)比較各突變體的酶活性、比活性和總蛋白濃度。任選兩種突變體為一對(duì),催化效力低者為起始物,高者為陽(yáng)性突變體。比較來(lái)自單個(gè)克隆的裂解液中尿酸酶活性或比活性均值判斷陽(yáng)性突變體。作受試品工作曲線(receiver-operation-curve,ROC),分析曲線下面積(area under curve,AUC)與酶催化效力比值的關(guān)系[12-13]。通過ROC分析得到滿足設(shè)定靈敏度和特異性要求的判斷閾值,以起始物的均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,用于測(cè)定裂解液中酶活性進(jìn)行篩選。

2結(jié)果

2.1尿酸酶活性的高通量測(cè)定

測(cè)定80，130和180 μmol/L尿酸在293 nm光吸收(各濃度測(cè)定30次,重復(fù)測(cè)定7批次),其吸收分別為1.186±0.019，1.579±0.032和1.855±0.044,這些尿酸濃度均在吸收的有效測(cè)定范圍內(nèi)且精度相當(dāng)。尿酸濃度越低,所測(cè)吸收受儀器噪聲干擾越大?？燎笱挎邨U菌尿酸酶對(duì)尿酸米氏常數(shù)高于200 μmol/L,測(cè)定其初速度要求尿酸消耗比例盡可能低,故需較高尿酸濃度才能獲得較寬可測(cè)范圍。因此,選用130 μmol/L尿酸測(cè)定活性。

在25 ℃下用130 μmol/L尿酸,分別以100，150，200，300倍稀釋尿酸酶突變體A的裂解液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),每隔2 min檢測(cè)293 nm吸收,連續(xù)監(jiān)測(cè)30 min。結(jié)果表明:①啟動(dòng)反應(yīng)3 min后,稀釋100，150，200和300倍裂解液的尿酸消耗量分別為11.8%，8.0%，7.4%，4.3%;②反應(yīng)20 min后,4種稀釋倍數(shù)樣品使反應(yīng)體系尿酸消耗分別為35%，27%，20%和15%;③稀釋300和200倍裂解液在7～21 min內(nèi)吸收線性下降,稀釋100和150倍的裂解液在3～13 min內(nèi)吸收線性下降。分析啟動(dòng)反應(yīng)3 min后數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)5～20 min間的尿酸酶反應(yīng)初速度對(duì)稀釋200倍的突變體A的量呈線性響應(yīng)(R2=0.989 6,n=5,圖1b),對(duì)應(yīng)初速度可測(cè)上限達(dá)到1.52 U/L。在130μmol/L尿酸時(shí)無(wú)尿酸酶作用30 min內(nèi)吸收隨機(jī)波動(dòng)小于0.04,而方法檢測(cè)下限為0,則此高通量測(cè)定系統(tǒng)對(duì)尿酸酶活性檢測(cè)下限約為0.04 U/L;此高通量測(cè)定尿酸酶活性過程為:裂解液100 μL(稀釋200倍),尿酸50 μL(終濃度為130 μmol/L),持續(xù)振蕩3 min后,以5.0 min間隔連續(xù)監(jiān)測(cè)20 min內(nèi)293 nm吸收變化,以啟動(dòng)反應(yīng)后8～28 min的數(shù)據(jù)計(jì)算初速度。

圖1　尿酸酶活性測(cè)定(a,尿酸酶突變體A在不同稀釋倍數(shù)下與130 μmol/L尿酸在293nm光吸收變化;b,尿酸酶突變體的加樣量與酶初速度的線性關(guān)系) Fig.1　Assay of uricase activity with microplate reader

2.2陽(yáng)性突變體的判斷方法

從突變體庫(kù)中篩選陽(yáng)性突變體的靈敏度和特異性越高越好。這需識(shí)別陽(yáng)性突變體的比較指標(biāo)及其閾值,突變體酶活性指標(biāo)大于此閾值即為陽(yáng)性突變體。有限位點(diǎn)突變的突變體催化效力變化有限,從中篩選出催化效力增加1倍的陽(yáng)性突變體是一個(gè)挑戰(zhàn)。本文以催化效力比值在1.3～4.0的4種尿酸酶突變體組合為模型建立識(shí)別陽(yáng)性突變體的判斷閾值。

F檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種突變體裂解液中總蛋白濃度無(wú)差異(P>0.05),而酶活性和比活性差異顯著(P<0.05, 見表1)。當(dāng)兩種突變體的比活性比值大于1.50后,比較其比活性的AUC>0.9，P<0.05且都高于分析酶活性所得 (表2),說明高通量方法測(cè)定尿酸酶比活性用于識(shí)別其陽(yáng)性突變體有一定優(yōu)勢(shì)[9]。可能因?yàn)楹蜻x突變體D表達(dá)效率偏低,使另外3種候選突變體與候選突變體D的比活性比值明顯大于純化后樣品所得催化效力比值,但其余3種候選突變體之間比活性比值與純化后測(cè)定催化效力比值差異較小。每對(duì)尿酸酶突變體間催化效力差異越大,ROC分析所得AUC越高。兩種尿酸酶間催化效力大于3.0后,ROC分析尿酸酶活性或比活性所得AUC都接近1.00。無(wú)論分析酶活性還是比活性都無(wú)法完全識(shí)別催化效力比值小于2.0時(shí)陽(yáng)性突變體,但兩種尿酸酶突變體間催化效力接近或大于2.0后ROC分析比活性的AUC大于0.95。所以,高通量方法測(cè)定尿酸酶的初速度進(jìn)行比較能用于識(shí)別催化效力提高接近1倍的陽(yáng)性突變體,且以突變體的比活性作為識(shí)別陽(yáng)性突變體靈敏度更高。

在篩選突變體庫(kù)時(shí)需從裂解液所得酶活性判斷其是否為陽(yáng)性突變體。候選突變體A與C裂解液樣品所得比活性比值與純化后催化效力比值≥1.69且差異較小;兩種突變體裂解液中尿酸酶比活性的變異系數(shù)一致(表1,2),故選A和C成對(duì)作ROC分析以確定識(shí)別陽(yáng)性突變體的閾值[15]。用Youden 指數(shù)(Youden index,YI)最大、設(shè)定敏感度80%和90%確定識(shí)別二者中高比活性者為陽(yáng)性突變體時(shí)所需比活性的閾值,分別為1.01，1.17和1.06 U/mg(表3和圖3)。 在篩選突變體庫(kù)時(shí)閾值較小會(huì)引入太多比活性較低的陽(yáng)性突變體而增加篩選工作量;設(shè)定敏感度過低可能丟失陽(yáng)性突變體。因此選擇敏感度為90%對(duì)應(yīng)最大特異度的比活性為閾值,即1.06 U/mg可作為識(shí)別A和C組合中的陽(yáng)性突變體的閾值。參照畸異值識(shí)別方法,可將此閾值換算成以起始物比活性均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示的參數(shù)作為識(shí)別陽(yáng)性突變體的通用閾值;上述閾值就等同于突變體C為起始物的比活性均值+1.7倍起始物比活性標(biāo)準(zhǔn)差,可作為陽(yáng)性突變體識(shí)別的閾值并有望通用于不同的起始物(表3)。

圖2　ROC判斷候選突變體A和C的閾值(n=30) Fig.2　ROC analysis of activities in lysates between uricase A and C (n=30)

突變體總蛋白濃度/mg·mL-1酶活性/U·mL-1比活性/U·mg-1χ±sCV(%)χ±sCV(%)χ±sCV(%)A0.22±0.0315.20.28±0.0516.41.30±0.2820.7B0.21±0.0313.90.24±0.0416.71.16±0.1411.8C0.22±0.0417.60.17±0.0425.20.77±0.1722.1D0.21±0.0522.70.04±0.0243.30.22±0.1565.3F0.859229.637191.147P0.4650.0000.000

用上述閾值,識(shí)別酶比活性之比大于1.7的A和C尿酸酶突變體組合中的陽(yáng)性突變體的敏感度大于90%,特異度大于93%;識(shí)別突變體酶比活性之比大于4.6的尿酸酶中的陽(yáng)性突變體,其敏感度和特異度都滿足篩選要求;識(shí)別酶比活性比值為1.5尿酸酶中的陽(yáng)性突變體,其敏感度接近80%,特異度大于93%,可見此閾值有通用性。

表2　ROC分析配對(duì)候選突變體的酶活性和比活性( n=30)

表3　識(shí)別尿酸酶突變體A和C陽(yáng)性突變體的閾值( n=30)

3討論

篩選酶突變體需高通量測(cè)定酶活性和準(zhǔn)確識(shí)別陽(yáng)性突變體的閾值。全自動(dòng)酶標(biāo)儀適合高通量測(cè)定酶活性。直接測(cè)定尿酸吸收跟蹤尿酸酶反應(yīng)過程計(jì)算尿酸酶初速度的效率最高。測(cè)定酶初速度時(shí)要求延遲時(shí)間內(nèi)底物消耗量盡可能低,用于分析數(shù)據(jù)中底物消耗比例不能超過設(shè)定界限,且米氏常數(shù)越高，測(cè)定初速度所允許的最大底物消耗比例越低。苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶米氏常數(shù)接近0.25 mmol/L,用盡可能高的尿酸濃度測(cè)定酶活性有助于提高識(shí)別高活性尿酸酶突變體的靈敏度,并允許較寬可測(cè)范圍。但最大尿酸濃度受到儀器測(cè)量范圍限制。故需優(yōu)化底物濃度、反應(yīng)時(shí)間和樣品稀釋比例建立高通量測(cè)定尿酸酶活性方法。

表4　尿酸酶候選突變體的特異度和敏感度

據(jù)裂解液中酶活性識(shí)別陽(yáng)性突變體需要的閾值,酶活性大于此閾值即為陽(yáng)性突變體;這種識(shí)別方法需盡可能高的靈敏度和特異性。在ROC分析中,各種可能cut-off值被嘗試為閾值考察識(shí)別陽(yáng)性突變體的特異性和敏感度。通過ROC分析確定閾值的常用方法包括[12-13]:①設(shè)定敏感度最低限對(duì)應(yīng)的最大特異度處cut-off值為閾值,通常設(shè)定敏感度的最低限為80～90%;②Youden指數(shù)(Youden index,YI)最大的cut-off值為閾值,YI=敏感度-(1-特異度),即敏感度和特異度的和最大,以最靠左上角的截割點(diǎn)為判斷參考范圍。綜合考慮,選擇敏感度為90%對(duì)應(yīng)最大特異度的比活性為判斷陽(yáng)性突變體的閾值。上述閾值等同于起始物C比活性均值+1.7倍起始物比活性的標(biāo)準(zhǔn)差;此閾值用于識(shí)別酶催化活力提高近1倍的尿酸酶陽(yáng)性突變體時(shí)敏感度和特異度都能滿足要求,可作為候選通用閾值。

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(編輯徐象平)