食管鱗狀細胞癌組織中轉移抑制基因、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達及臨床意義

黃志軍林建清陳志耀楊寧

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，福建泉州362000)

摘要〔〕目的探討食管鱗狀細胞癌組織中轉移抑制基因(nm23-H1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白的表達及其臨床意義。方法選取手術切除并經(jīng)病理學證實的食管鱗狀細胞癌標本30例及正常食管黏膜標本30例，采用免疫組化S-P法檢測nm23-H1、MMP-2蛋白在食管鱗狀細胞癌組織和正常食管黏膜中的表達。結果nm23-H1蛋白在食管鱗狀細胞癌中的陽性率為43.3%(13/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為100%(30/30)，兩者間差異顯著(χ2=22.083，P<0.05)。MMP-2蛋白在食管鱗狀細胞癌中的陽性率為90.0%(27/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為33.3%(10/30)，兩者間差異顯著(χ2=28.370，P<0.05)；nm23-H1、MMP-2在食管鱗癌中的表達與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、浸潤深度及有無淋巴結轉移有關(P<0．05)；nm23-H1的表達與切端癌殘留有關(P<0.05)，MMP-2的表達與切端癌殘留無關(P>0.05)；食管鱗狀細胞癌中nm23-H1與MMP-2的表達呈負相關性。結論nm23-H1、MMP-2均在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，均可促進遠處轉移的發(fā)生；nm23-H1的表達缺失可能與切端癌殘留有關；nm23-H1、MMP-2可作為判斷食管癌轉移及預后的指標。

關鍵詞〔〕食管鱗狀細胞癌；轉移抑制基因；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；免疫組化

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：黃志軍(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事食管癌、結直腸癌、胃癌研究。

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的侵襲力，發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，發(fā)展迅速且生存率較低，已引起人們的廣泛關注。nm23基因是近年發(fā)現(xiàn)的轉移抑制基因，在人類基因組中有nm23-H1和nm23-H2，前者與癌細胞轉移的關系更為密切?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)，是MMP家族中的重要成員之一，可以降解基膜中的膠原和細胞間基質(zhì)，促進腫瘤的擴散轉移〔1〕。本研究通過免疫組化方法檢測nm23-H1、MMP-2在食管鱗狀細胞癌及正常食管黏膜中的表達，并探討其臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料收集2010年1月至2012年1月期間我院手術切除并經(jīng)病理學證實的食管鱗狀細胞癌標本30例。所有病例資料完整，取材前均未經(jīng)化療或放療。所有標本均經(jīng)病理專家診斷認定。其中，男21例，女9例；年齡50～66歲，平均(86±6)歲。手術切除組織均經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋切片。伴有區(qū)域淋巴結轉移13例，無淋巴結轉移17例。依據(jù)TNM分期標準將所有患者分為Ⅰ～Ⅳ期。本研究中Ⅰ+Ⅱ期6例，Ⅲ+Ⅳ期24例。同時選取正常食管黏膜標本30例，男18例，女12例；年齡50～70歲，平均(55±5)歲。并去其血清標本。兩組患者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2主要儀器及試劑MMP-2 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；nm23-H，單克隆抗體(鼠抗人，Cruz公司)。美國Bio-rad 505酶標儀；微量移液器(美國Eppendorf公司)；小型高速低溫離心機(Sigma，德國)；微量振蕩器(江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠)。

1.3MMP-2檢測①取出凍存標本，在室溫下融化，并設標準曲線的抗體標準濃度。②加入已按要求倍數(shù)稀釋的抗體標準液和標本至相應孔內(nèi)，用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育120 min。③按洗滌方法洗板。除空白孔外，每孔加按說明書要求稀釋的生物素標注的二抗100 μl，封住板孔，室溫孵育90 min。⑤按洗滌方法洗板。⑥除空白孔外，每孔加已按要求稀釋的酶聯(lián)物100 μl，封住板孔，室溫30 min。⑦按洗滌方法洗板。⑧每孔加底物A、B各50 μl，避光20 min。⑨每孔加終止液50 μl，即刻在450 nm酶標儀測定標本的吸光度，畫出標準曲線，計算出樣本的MMP-2的水平。檢測由同一檢驗師操作，步驟嚴格按照操作說明進行，嚴格質(zhì)控。使用前將所有試劑帶到室溫條件下。所有的待測樣本、標準品以及控制對照均需雙份測定。

1.4nm23-H1檢測載玻片經(jīng)常規(guī)處理后，涂防脫片膠APES(50 ml丙酮中加入APES 1 ml)，烤箱烘干后備用，標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，然后切片后備用。免疫組化：切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水后，實驗組加nm23-H1，I抗(稀釋倍數(shù)1∶50)置濕盒4℃冰箱過夜，之后加Ⅱ抗(羊抗鼠LgG)室溫下反應40 min，再加Ⅲ抗。室溫下反應40 min。最后DAB顯色2～8 min，在顯微鏡下觀察顯色情況。實驗對照：在反應中省略第一抗體作為陰性對照。免疫組織化學染色嚴格按照SP試劑盒說明書進行。蛋白表達情況據(jù)Shiozaki等〔2〕介紹的方法進行定性及半定量分類。

1.5結果判定標準nm23-H1、MMP-2陽性表達均位于細胞質(zhì)中，顯示黃棕色顆?；驁F塊。鏡下選擇有代表性的5個視野(400倍)，總計數(shù)>1 000個細胞。按陽性細胞所占百分數(shù)分為：陽性細胞率<25%為陰性(-)；>125%為陽性(+)。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件包進行χ2檢驗、Fisher確切概率法分析，相關性采用列聯(lián)資料χ2檢驗分析。

2結果

2.1nm23-H1、MMP-2表達情況nm23-H1蛋白在食管鱗狀細胞癌中的陽性率為43.3%(13/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為100%(30/30)，兩者間差異顯著(χ2=22.083，P<0.05)。MMP-2蛋白在食管鱗狀細胞癌中的陽性率為90.0%(27/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為33.3%(10/30)，兩者間差異顯著(χ2=28.370，P<0.05)。

2.2nm23-H1、MMP-2表達與食管鱗癌臨床病理資料的關系見表1。nm23-H1、MMP-2在食管鱗癌中的表達與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、浸潤深度及有無淋巴結轉移有關(P<0.05)；nm23-H1的表達與切端癌殘留有關(P<0.05)，MMP-2的表達與切端癌殘留無關(P>0.05)。

表1　nm23-H1、MMP-2表達與食管鱗癌臨床病理

2.3nm23-H1與MMP-2在食管鱗癌中表達的相關性食管鱗狀細胞癌中nm23-H1與MMP-2的表達呈負相關性(列聯(lián)系數(shù)=-0.353，P=0.007)。

3討論

nm23是美國國立癌癥研究所于1988年分離并證實與腫瘤轉移抑制有關的基因，nm23-H1基因是該基因家族中六個成員之一，與腫瘤轉移的關系最密切，引起人們的廣泛關注〔3，4〕。其在不同腫瘤中的作用機制不同且比較復雜，目前認為nm23-H1基因編碼產(chǎn)物二磷酸核苷激酶(NDPK)參與微管的集合和分解，改變細胞骨架形態(tài)，影響細胞的活動和細胞間的黏附，起到抑制腫瘤轉移的作用〔5，6〕。nm23-H1基因突變或缺失，造成對細胞減數(shù)分裂障礙和移動的抑制作用喪失，影響細胞的分化及發(fā)育并促進腫瘤發(fā)展〔7～9〕。nm23-H1蛋白在食管鱗狀細胞癌中異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移的關系，各家的報道稍有差異。有研究認為nm23在分化低的食管癌中表達明顯低于中高分化癌，且在淋巴結轉移組表達顯著低于無淋巴結轉移〔10〕。相關研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，nm23-H1蛋白在高分化食管癌中表達高于中低分化癌，但差異無統(tǒng)計學意義，認為nm23-H1與食管癌的分化程度無關。近年又有研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，nm23-HI蛋白的表達與食管癌的浸潤深度、有無淋巴結轉移等相關。本實驗顯示nm23-H1基因表達缺失與食管鱗癌的發(fā)生密切相關，可能在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，其表達減少或不表達可以促進腫瘤的發(fā)生及浸潤轉移，還可能導致手術切端癌殘留，可作為臨床上判斷食管鱗癌轉移及預后的指標之一〔13～15〕。MMP-2是MMPs家族中的重要成員之一，具有降解細胞外基質(zhì)和基底膜的功能，過高表達可能在腫瘤細胞的浸潤、轉移中起到重要作用〔16〕。本實驗結果發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達與性別、年齡、切端癌殘留及腫瘤大小無關，而與腫瘤的分化程度、浸潤深度及有無淋巴結轉移有關，與相關文獻報道基本一致〔17〕，表明MMP-2與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關，過高表達可促進腫瘤的局部浸潤和遠處轉移，也可作為判斷食管鱗癌預后的分子標志。nm23-H1與MMP-2在食管癌中的表達呈負相關，兩者分別作為腫瘤擴散的抑制因素和促進因素，在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。nm23-H1的表達缺失和MMP-2的過高表達均可造成食管癌的發(fā)生和轉移，兩者的異常表達可能有協(xié)同作用〔18〕。因此，同時檢測兩個指標在食管鱗癌組織中的表達，能更準確的預示腫瘤的轉移及預后情況，兩者間的相互作用機制還有待進一步研究。

4參考文獻

1SawaJl A，Jouve M，Mac Dmbe ML，etal.NDPK nn23 expression in human breast cancer in relation to relapse survival，and other prognostic factor：an immunohistochemical study〔J〕. J Pathol，1994;172(1)：27-33.

2Shiozaki H，Talmra H,Oka H，etal.Expression of irmmnoreactive Ecadhesion molecules in human cancers〔J〕.Am J Pathol，1991;139(6)：17-20.

3Vallbohmer D，Lenz HJ.Predictive and prognostic molecular marker in outcome of esophageal cancer〔J〕.Dis Esophagus，2006;19(6)：425-32.

4Garzil L，Roma C，Tata N，etal.H-prune-nm23-H1 protein complex and correlation to pathways in cancer metastasis〔J〕 .J Metastasis，2003;20(1)：3-10.

5Szumilo J，Skomra D，Chibowski D，etal.Immunoexpression of nm23 in advanced esophageal aquamous cell carcinoma〔J〕 .Folia Histochem Cytobiol，2002;40(4)：377-80.

6王川，張祥福，楊發(fā)端，等.nm23基因在食管癌中的表達的免疫組化研究〔J〕 .腫瘤，1998;18(1)：21,23.

7猶東，高平.食管癌中P53與nm23-H1基因表達的臨床意義〔J〕 .寧夏醫(yī)學雜志，2007;29(10)：869-70.

8劉敏，郭曉娟，張霞，等.食管癌中EGFRvⅢ、MMP-2的表達特點及意義〔J〕 .現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2010;18(1)：62-6.

9Janica A.turd3蛋白在腺型原位及浸潤型乳腺癌中的表達〔J〕.國外醫(yī)學遺傳學分冊，1994;17(3)：146-7.

10He YT，Hou J，Qiao CY，etal.An analysis of esophageal cancer incidence in Cixian county from 1974 to 1996〔J〕 .World J Gastroenterol，2003;9(2)：209-13.

11萬彥彬.結直腸癌患者血清中MMP-2、MMP-9和MMP-14檢測的臨床意義〔J〕 .右江醫(yī)學，2010;38(2)：131-3.

12Qi Y，Chiu JF，Wang L，etal.Comparative proteomic analysis of e-sophageal squamous cell carcinoma〔J〕 .Proteomics，2005;5(11)：2960,2971.

13孫麗艷，趙詠桔.血清IGFl、MMP-2、IGFBIr3與結腸直腸癌侵襲、轉移關系的研究〔J〕 .診斷學理論與實踐，2009;8(4)：424-7.

14羅力，龐久玲，許志萍，等.基質(zhì)金屬蛋白酶2在胃癌組織中的表達及意義〔J〕 .山東醫(yī)藥，2008；48(16)：39-40.

15Lee KH，Kim JR.Kiss-1 suppresses MMP-9 expression by activating p38 MAP kinase in human stomach cancer〔J〕 .Oncol Res，2009；18(2-3)：107-16.

16杜日昌，譚麗珊，陳智慧，等.Caveolin-1與MMP-2在食管癌的表達及其臨床意義〔J〕 .實用腫瘤雜志，2011；26(1)：25-9.

17劉真君，吳家玉，胥萍瑤，等.食管癌術后肺部感染患者機械通氣時間影響因素分析〔J〕 .中國基層醫(yī)藥，2011；18(20)：35-6.

18王亞飛，祝淑釵，沈文斌，等.食管癌中MMP-9蛋白表達及其臨床意義〔J〕 .河北醫(yī)科大學學報，2008；29(3)：328，332.

〔2013-09-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)