降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)維甲酸致老年骨質(zhì)疏松大鼠OPG/RANKL信號(hào)通路的影響及療效

陳光華黃貴芝林顥吳浩俊陳航

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科中心，廣東湛江524001)

摘要〔〕目的探討降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對(duì)維甲酸致老年骨質(zhì)疏松大鼠骨保護(hù)素(OPG)/核因子κB受體活化因子配體(RANKL)信號(hào)通路的影響及療效。方法72只15月齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、維甲酸組、CGRP組和CGRP8-37(CGRP拮抗劑)組，每組18只；后3組用維甲酸80 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃2 w。維甲酸組腹腔注射生理鹽水1 ml，1次/d，6次/w；CGRP組腹腔注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次/d，6次/w；CGRP8-37組先腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP8-37(30 μg/kg)，再向腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次，6次/w；以上各組均干預(yù)2 w。采用雙能X射線骨密度儀檢測(cè)大鼠股骨骨密度(BMD)；比較各組血清白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、OPG和 RANKL水平；RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠骨組織OPG mRNA和 RANKL mRNA表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，維甲酸組大鼠左、右股骨BMD明顯降低(P<0.05)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠左、右股骨BMD均顯著升高(P<0.05)；而CGRP8-37組大鼠左、右股骨BMD均明顯低于CGRP組(P<0.05)。與對(duì)照組比較，維甲酸組大鼠血清OPG水平和骨組織OPG mRNA表達(dá)明顯下降，而血清RANKL、IL-1、IL-6、TNF-α水平和骨組織RANKL mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠血清OPG和骨組織OPG mRNA明顯升高，而血清RANKL、IL-1、IL-6、TNF-α水平和骨組織RANKL mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠血清OPG水平和骨組織OPG mRNA明顯低于CGRP組，而血清RANKL、IL1、IL-6、TNF-α水平和骨組織RANKL mRNA顯著高于CGRP組(P<0.01)。結(jié)論降鈣素基因相關(guān)肽可明顯提高維甲酸老年骨質(zhì)疏松大鼠股骨BMD，其作用可能與抑制機(jī)體IL-1、IL-6、TNF-α水平從而調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕降鈣素基因相關(guān)肽；維甲酸；骨質(zhì)疏松；骨保護(hù)素；核因子κB受體活化因子配體

中圖分類號(hào)〔〕R69〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：陳航(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科、骨質(zhì)疏松研究。

第一作者：陳光華(1980-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科、骨質(zhì)疏松研究。

骨質(zhì)疏松臨床以骨量減少和骨組織結(jié)構(gòu)退化為病理特征，由于骨的脆性增加以致易于發(fā)生骨折，為骨科常見(jiàn)病，以中老年人多見(jiàn)〔1〕。目前骨質(zhì)疏松的病因尚不十分清楚，如可能與降鈣素、甲狀旁腺素、性激素以及維生素等代謝異常關(guān)系密切。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)作為一種多生物活性神經(jīng)肽，與降鈣素在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定相似性，近年其對(duì)骨質(zhì)疏松的作用受到廣泛關(guān)注。人體破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞均有CGRP受體，CGRP能夠與這些受體結(jié)合調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的功能，從而對(duì)骨的生長(zhǎng)、修復(fù)以及改建等方面發(fā)揮重要作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP在骨質(zhì)疏松患者外周血中含量明顯增高，且伴隨骨密度(BMD)的降低CGRP含量逐漸升高〔3〕；因此，CGRP在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到重要調(diào)節(jié)作用；然而，關(guān)于CGRP直接干預(yù)治療骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采取大鼠維甲酸骨質(zhì)疏松為模型，觀察CGRP及其拮抗劑對(duì)股骨BMD的影響以及可能機(jī)制。

1資料與方法

1.1動(dòng)物72只15月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量260～300 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk桂2009-0002；大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，溫度控制在(24±2)℃，相對(duì)濕度控制在(60±2)%，12 h/12 h明暗周期，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境3 d。

1.2主要試劑與儀器CGRP和CGRP8-37(CGRP受體拮抗劑)購(gòu)于Sigma公司，維甲酸(純度99.12%)由陜西森弗生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)、骨保護(hù)素(OPG)ELISA檢測(cè)試劑盒由上海廣銳生物科技有限公司提供，Trizol為美國(guó) Invitrogen 公司產(chǎn)品，PCR引物購(gòu)于大連寶生物公司，反轉(zhuǎn)錄和SYBR Premix Ex TaqTM PCR Kit 為日本 TaKaRa 公司產(chǎn)品；MEDI LINK雙能X線骨密度檢測(cè)儀，法國(guó)Osteospace公司生產(chǎn)；Model680型酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；ABI7500熒光定量PCR儀為美國(guó)Life Technology公司產(chǎn)品。

1.3分組與造?！?〕72只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、維甲酸組、CGRP組和CGRP8-37組，每組18只；后3組用維甲酸80 mg·kg-1·d-1灌胃，對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)2 w，各組大鼠給予相應(yīng)干預(yù)措施；對(duì)照組和維甲酸組：腹腔注射生理鹽水1 ml，1次/d，6次/w。CGRP組：腹腔注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次/d，6次/w。CGRP8-37組：先腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP8-37(30 μg/kg)，5～8 min后再向腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次，6次/w。以上各組均干預(yù)2 w。

1.4大鼠股骨BMD測(cè)定大鼠均采取0.2%戊巴比妥鈉溶液(0.01 ml/kg)腹腔注射麻醉，取大鼠左、右股骨，采用雙能X線骨密度儀測(cè)定大鼠左、右股骨BMD。

1.5Elisa法檢測(cè)大鼠血清指標(biāo)大鼠均用0.2%戊巴比妥鈉溶液(0.01 ml/kg)腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，正中切口暴露心臟后采血，室溫靜置1 h，離心10 min，取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆?；檢測(cè)指標(biāo)包括血清IL-6、IL-1、TNF-α、RANKL和OPG，均嚴(yán)格按ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.6RT-PCR檢測(cè)大鼠骨組織OPG和RANKL mRNA表達(dá)大鼠均采取0.2%戊巴比妥鈉溶液(0.01 ml/kg)腹腔注射麻醉，取右下肢1 cm骨組織，充分勻漿，用Trizol法抽提總RNA；取2 μg RNA，行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性處理5 min，94℃變性處理40 s，56℃退火30 s，72℃進(jìn)行35 s，共反應(yīng)32個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min，采用β-actin為內(nèi)參；OPG上游引物：5’-TGGCTGAGTGTYCTGGTGGA-3’，反義引物：5’TGACGGTmGGGAAAGTGG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度430 bp；β-actin上游引物：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’，反義引物：5’-CGTGAGAAGGTCGGAAGGAA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度527 bp；RANKL上游引物：5’-CTATGATGGAAGGTTCGTGGC-3’；反義引物：5’-CTTGGGATTTTGATGCTGGTT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度319 bp；反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠雙側(cè)股骨BMD比較與對(duì)照組比較，維甲酸組大鼠左、右股骨BMD明顯降低(P<0.05)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠左、右股骨BMD均顯著升高(P<0.05)；而CGRP8-37組大鼠左、右股骨BMD均明顯低于CGRP組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠雙側(cè)股骨BMD比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與維甲酸組比較：2)P<0.05；與CGRP組比較：3)P<0.05

2.2各組大鼠血清OPG和RANKL水平比較與對(duì)照組相比，維甲酸組大鼠血清OPG明顯下降，而RANKL水平明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠血清OPG明顯升高，而RANKL水平顯著降低(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠血清OPG水平明顯低于CGRP組，而RANKL水平顯著高于CGRP組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠血清OPG和 RANKL水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與維甲酸組比較：2)P<0.01；與CGRP組比較：3)P<0.01，下表同

2.3各組大鼠骨組織OPG和RANKL mRNA表達(dá)比較與對(duì)照組比較，維甲酸組大鼠骨組織OPG mRNA表達(dá)明顯下降，RANKL mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠骨組織OPG mRNA明顯升高，RANKL mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠骨組織OPG mRNA明顯少于CGRP組，RANKL mRNA明顯高于CGRP組(P<0.01)，見(jiàn)圖1和表3。

2.4各組大鼠血清IL-1，IL-6和TNF-α水平比較與對(duì)照組相比，維甲酸組大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-α均明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠血清IL1、IL-6和TNF-α水平均顯著高于CGRP組(P<0.01)，見(jiàn)表4。

圖1　CGRP對(duì)OPG和RANKL mRNA表達(dá)的影響

組別OPG/β-actinRANKL/β-actinOPG/RANKL對(duì)照組0.93±0.060.32±0.012.91±0.4維甲酸組0.38±0.021)0.91±0.041)0.42±0.031)CGRP組0.88±0.052)0.34±0.022)2.59±0.282)CGRP8-37組0.40±0.033)0.89±0.053)0.45±0.023)

表4　各組血清IL-1，IL-6和TNF-α水平比較

3討論

骨重建過(guò)程包括兩個(gè)過(guò)程，即破骨細(xì)胞激活骨吸收開始和成骨細(xì)胞激活骨形成終結(jié)，期間局部多種因子通過(guò)平衡破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)換速度的調(diào)控〔5〕；OPG、RANKL、RANK均為TNF超家族成員，對(duì)骨的形成和吸收方面發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用〔6〕。RANK作為RANKL目前唯一的已知受體，在破骨前體細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞表面大量表達(dá)，RANK與成熟破骨細(xì)胞表面RANKL結(jié)合能夠直接引起破骨細(xì)胞的分化和活化〔7〕；而位于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK，已被證實(shí)在破骨細(xì)胞分化及活化中起到關(guān)鍵作用〔8〕。OPG主要由成骨細(xì)胞譜系的各種細(xì)胞產(chǎn)生，常以分泌蛋白形式存在，作為RANKL的誘騙受體，競(jìng)爭(zhēng)性抑制RANKL結(jié)合成骨細(xì)胞表面RANK，從而阻斷其信號(hào)通路，抑制破骨細(xì)胞的生存、分化活化過(guò)程，相反促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞凋亡〔9〕；因此，在骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中，RANKL/OPG起到重要杠桿調(diào)節(jié)作用。

OPG和RANKL均由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，也是破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間相互作用的局部調(diào)節(jié)因子之一；OPG/RANKL的比值受骨吸收與骨形成狀況的影響，其高低是破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵性因素〔10〕；抑制甚至阻止RANKL與破骨細(xì)胞表面RANK相結(jié)合，提高OPG/RANKL比值將抑制破骨細(xì)胞活化、分化及程度，從而實(shí)現(xiàn)骨質(zhì)疏松防治目的〔10〕。

本研究結(jié)果表明，CGRP可能經(jīng)調(diào)節(jié)OPG/RANKL比值的平衡，抑制破骨細(xì)胞活化、分化和成熟，從而阻斷破骨細(xì)胞的骨吸收過(guò)程，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用。為了更好地證實(shí)上述結(jié)果，本研究在CGRP治療前采取CGRP8-37進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，在影響B(tài)MD水平和調(diào)節(jié)OPG、RANKL表達(dá)上明顯低于CGRP組，且與對(duì)照組相比變化無(wú)顯著差異。

以往通過(guò)選擇性切斷大鼠神經(jīng)脛骨骨折模型研究表明，在骨折愈合過(guò)程中CGRP可通過(guò)平衡OPG/RANKL比值，間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活化、分化等達(dá)到治療骨折愈合的作用〔11〕。CGRP也可促進(jìn)OPG/RANKL比值升高，本實(shí)驗(yàn)與上述研究報(bào)道結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性，提示，CGRP能夠經(jīng)調(diào)節(jié)OPG/RANKL比值來(lái)調(diào)節(jié)RANKL-RANKL-OPG體系，進(jìn)而調(diào)控骨的吸收與形成。那么CGRP是如何作用與OPG/RANKL杠桿的呢？本研究還進(jìn)一步研究了CGRP對(duì)RANKL-RANKL-OPG體系的上游作用途徑的影響；免疫應(yīng)答因子IL-1、IL-6和TNF-α均能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞RANKL表達(dá)以及破骨細(xì)胞的產(chǎn)生、活化〔12〕；IL-1能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞TNF 受體相關(guān)因子6的表達(dá)，提高RANKL/RANK信號(hào)通路級(jí)聯(lián)，直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化〔13〕；TNF-α經(jīng)正向調(diào)節(jié)RANKL產(chǎn)生，進(jìn)而使破骨細(xì)胞形成增多〔14〕。IL-6通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞上RANK表達(dá)及成骨細(xì)胞上RANKL表達(dá)，經(jīng)RANK信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化〔15〕。

本研究顯示，CGRP可能經(jīng)抑制大鼠IL-1、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)，抑制OPG/RANKL體系，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的作用，達(dá)到骨質(zhì)疏松治療作用。

我們知道，MAPK介導(dǎo)的信號(hào)途徑是RANKL-RANKL-OPG體系向下游傳遞信號(hào)的主要通路，那么在CGRP抑制IL-1、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)，減弱RANKL-RANKL信號(hào)傳遞而增強(qiáng)OPG/RANKL系統(tǒng)的反應(yīng)中，其對(duì)下游信號(hào)的調(diào)節(jié)又如何，有待于進(jìn)一步探討。

4參考文獻(xiàn)

1劉東,孫遠(yuǎn)新,張克非,等.微創(chuàng)經(jīng)皮椎弓根固定聯(lián)合傷椎椎體成形術(shù)治療中老年骨質(zhì)疏松性胸腰椎骨折36例〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2012;32(12):2641-2.

2Bo Y,Yan L,Gang Z,etal.Effect of calcitonin gene-related peptide on osteoblast differentiation in an osteoblast and endothelial cell co-culture system〔J〕.Cell Biol Int,2012;36(10):909-15.

3Notoya M,Arai R,Katafuchi T,etal.A novel member of the calcitonin gene-related peptide family,calcitonin receptor-stimulating peptide,inhibits the formation and activity of osteoclasts〔J〕.Eur J Pharmacol,2007;560(2-3):234-9.

4孫煒,趙效國(guó),李小玲.骨質(zhì)疏松模型大鼠骨磷、骨鈣含量測(cè)定〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2010;16(7):490-2.

5廖二元,譚利華.代謝性骨病學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:184-228.

6陳居銪,陳鴻輝.OPG/PANK/PANKL細(xì)胞信號(hào)通路在骨性關(guān)節(jié)炎中作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)矯形外科雜志,2011;19(5):395-7.

7Ostrowska Z,Ziora K,Owicimska J,etal.RANKL/RANK/OPG system and bone status in females with anorexia nervosa〔J〕.Bone,2012;50(1):156-60.

8Lee B,Kim TH,Jun JB,etal.Direct inhibition of human RANK+ osteoclast precursors identifies a homeostatic function of IL-1beta〔J〕.J Immunol,2010;185(10):5926-34.

9Dougall WC.Molecular pathways:osteoclast-dependent and osteoclast-independent roles of the RANKL/RANK/OPG pathway in tumorigenesis and metastasis〔J〕.Clin Cancer Res,2012;18(2):326-35.

10Chen B,Li XD,Liu DX,etal.Canonical Wnt signaling is required for Panax notoginseng saponin-mediated attenuation of the RANKL/OPG ratio in bone marrow stromal cells during osteogenic differentiation〔J〕.Phytomedicine,2012;19(11):1029-34.

11楊亞?wèn)|,周娟,高輝,等.失神經(jīng)支配在大鼠骨折愈合過(guò)程中降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)骨保護(hù)素/破骨細(xì)胞分化因子影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華手外科雜志,2012;28(4):233-7.

12Jurado S,Garcia-Giralt N,Díez-Pérez A,etal.Effect of IL-1beta,PGE(2) ,and TGF-beta1 on the expression of OPG and RANKL in normal and osteoporotic primary human osteoblasts〔J〕.J Cell Biochem,2010;110(2):304-10.

13Kim JH,Jin HM,Kim K,etal.The mechanism of osteoclast differentiation induced by IL-1〔J〕.J Immunol,2009;183(3):1862-70.

14Zupan J,Komadina R,Marc J.The relationship between osteoclastogenic and anti-osteoclastogenic pro-inflammatory cytokines differs in human osteoporotic and osteoarthritic bone tissues〔J〕.J Biomed Sci,2012;19(1):28.

15Yoshitake F,Hoh S,Narita H,etal.Intedeukin-6 directly inhibits osteoelast differentiation by suppressing receptor aetivatorof NF-kappaB signaling pathways〔J〕.J Biol Chem,2008;283(17):11535-40.

〔2014-06-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)