沉默LAIR-1表達對乳腺癌細胞增殖和侵襲功能的影響

趙徽安雪青呂健東

(天津市第五中心醫(yī)院普外科，天津300450)

摘要〔〕目的探討白細胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體(LAIR)-1在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。方法采用RT-PCR方法檢測乳腺癌細胞系和組織標(biāo)本中LAIR-1 mRNA的表達情況。采用電穿孔轉(zhuǎn)染法，將LAIR-1 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，通過Western印跡檢測LAIR-1在MCF-7細胞中的表達情況。通過四甲基偶氮唑藍比色(MTT)增殖實驗檢測LAIR-1對MCF-7細胞增殖的影響。通過傷Boyden小室檢測LAIR-1對MCF-7細胞侵襲能力的影響。結(jié)果同癌旁組織相比，乳腺癌組織中LAIR-1 mRNA的表達量顯著降低(P<0.01)；且同非轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織相比，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中LAIR-1 mRNA的表達量亦顯著降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA可顯著抑制MCF-7細胞中LAIR-1的表達。抑制LAIR-1表達后，MCF-7細胞的增殖和侵襲能力均顯著升高(P<0.01)。結(jié)論LAIR-1具有抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲的作用，乳腺癌組織中LAIR-1的低表達可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕白細胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體-1；乳腺癌；增殖；侵襲

中圖分類號〔〕R739〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：呂健東(1967-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事甲狀腺、乳腺、胃腸道腫瘤研究。

第一作者：趙徽(1985-)， 女，碩士，主要從事專業(yè)乳腺外科研究。

乳腺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，然而乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制目前尚未完全研究清楚。白細胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體(LAIR)-1是一種具有免疫抑制功能的受體〔1〕。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌組織細胞和細胞系中存在不同水平的表達，且沉默卵巢癌細胞系(HO8910)細胞中LAIR-1分子表達可明顯增強HO8910細胞的增殖能力〔2〕。關(guān)于LAIR-1分子在乳腺癌組織中的表達情況及其與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前還未見相關(guān)文獻報道。本文旨在探討LAIR-1分子在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為乳腺癌診斷尋找一個新的有效的腫瘤分子標(biāo)志物。

1材料與方法

1.1臨床資料選取2013 年10月11日至2014 年12月30日我院乳腺外科收治的乳腺癌患者60例，平均年齡(61.3±14.8)歲，其中轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者和非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者各30例。術(shù)前均未接受任何放化療和免疫治療。收取乳腺癌患者的癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本，離體后均立即凍存于液氮中，均經(jīng)過組織病理學(xué)診斷證實為乳腺癌。

1.2細胞及主要試劑人乳腺癌細胞系(MD231)及MCF7細胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，Lonza轉(zhuǎn)染試劑購自Lonza公司； TRIzol購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒購自Ambion公司；侵襲實驗用Boyden小室購自美國Millipore公司。

1.3RT-PCR 取出液氮中保存的組織，研碎，采用Trizol提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40個循環(huán)。以2-△△Ct方法計數(shù)LAIR-1的相對表達量。LAIR-1上游引物：5'-CCGTCGGACAACAGTCACAA-3'；下游引物：5'-CGTCGGACAACAGTCACAATTT-3'。細胞長至70%融合時可用于轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lonza轉(zhuǎn)染說明書進行操作，轉(zhuǎn)染36 h后可用于功能實驗〔3〕。采用Western印跡方法檢測MCF-7細胞中LAIR-1的表達情況〔4〕，四甲偶氮唑藍比色(MTT)方法檢測LAIR-1對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響〔5〕。采用Boyden小室分析檢測細胞侵襲能力〔5〕。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1LAIR-1在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中的表達乳腺癌癌旁組織中，LAIR-1的相對表達量為1.38±0.15，乳腺癌組織中為0.54±0.05，二者相比差異顯著(P<0.01)。非轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的LAIR-1的相對表達量為0.64±0.11，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中為0.33±0.02，二者相比差異顯著(P<0.01)。低侵襲能力的乳腺癌細胞系MCF-7中LAIR-1的相對表達量為0.93±0.22，高侵襲能力的乳腺癌細胞系MD231中為0.69±0.16，二者相比差異顯著(P<0.01)。

2.2轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞中LAIR-1表達檢測轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞中LAIR-1的表達被顯著抑制。見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌 MCF-7細胞中LAIR-1表達檢測

2.3siRNA干擾抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力乳腺癌MCF-7細胞轉(zhuǎn)染第3天時，增殖能力在模擬組、對照組和轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA組分別為(0.67±0.11)、(0.69±0.09)和(1.14±0.14)；第5天時，分別為(1.17±0.21)、(1.19±0.18)和(2.07±0.41)；第7天時，分別為(1.86±0.23)、(1.91±0.25)和(2.56±0.26)。轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞增殖能力顯著升高(P<0.01)。

2.4siRNA干擾抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞發(fā)生侵襲的細胞數(shù)分別為(46.24±13.54)、(45.36±15.63)和(106.13±25.46)。轉(zhuǎn)染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力顯著升高(P<0.01)。見圖2。

圖2　LAIR-1對乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的影響

3討論

腫瘤是世界人口死亡的第2大原因，近30年來世界范圍內(nèi)腫瘤致死率增加近2倍〔6〕。腫瘤種類約有200多種，其中乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌總發(fā)病率約占所有癌癥發(fā)生率的一半以上〔7〕。乳腺癌是腫瘤最常見的一種類型，占腫瘤發(fā)病率的27%，致死率占腫瘤致死率的16%。已知乳腺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。然而，乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制目前尚未完全研究清楚。

LAIR-1是一種具有免疫抑制功能的受體，含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)〔2～4〕。LAIR-1主要表達于髓系細胞和淋巴細胞中，包括自然殺傷(NK)細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、單核細胞來源樹突細胞(DC)和造血祖細胞〔8～10〕。結(jié)合以往研究結(jié)果證實高表達于免疫細胞的多種抑制性受體家族成員，

如程序死亡受體-1(PD-1)和NK細胞抑制性受體(NKG2A)均與腫瘤免疫逃逸相關(guān)。國內(nèi)已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞也表達LAIR-1〔11〕，推測LAIR-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌組織細胞和細胞系中存在不同水平的表達，且沉默卵巢癌細胞系(HO8910)細胞中LAIR-1分子表達可明顯增強HO8910細胞的增殖能力。雖然已證實LAIR-1在卵巢癌中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于LAIR-1表達于乳腺癌腫瘤細胞的報道還沒有，且其作用機制尚未完全明確。

本研究結(jié)果初步提示LAIR-1分子與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另外，當(dāng)敲低乳腺癌MCF-7細胞中LAIR-1分子的表達后，乳腺癌MCF-7細胞的增殖和侵襲能力均顯著升高。

綜上，LAIR-1分子可通過影響乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力進而發(fā)揮乳腺癌抑制作用。乳腺癌中LAIR-1分子表達的顯著降低與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

4參考文獻

1王雷，馬菲，郭寶良.MicroRNA在三陰型乳腺癌中的研究進展〔J〕.中國普通外科雜志，2013;22(11)：1490-4.

2何曉麗，付愛麗，曹奇志，等.沉默LAIR-1表達對卵巢癌細胞增殖功能的影響〔J〕.現(xiàn)代免疫學(xué)，2015;35(2)：119-23.

3Yin S,Zhang J,Mao Y,etal.Vav1-phospholipase C-γ1 (Vav1-PLC-γ1) pathway initiated by T cell antigen receptor (TCRγδ) activation is required to overcome inhibition by ubiquitin ligase Cbl-b during γδT cell cytotoxicity〔J〕.J Biol Chem,2013;288(37):26448-62.

4Kim HS,Das A,Gross CC,etal.Synergistic signals for natural cytotoxicity are required to overcome inhibition by c-Cbl ubiquitin ligase〔J〕.Immunity,2010;32(2):175-86.

5Wang X,Pan J,Li J.Cytokine-induced apoptosis inhibitor 1 inhibits the growth and proliferation of multiple myeloma〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(2):2056-62.

6Harirchi I,Kolahdoozan S,Karbakhsh M,etal.Twenty years of breast cancer in Iran:downstaging without a formal screening program〔J〕.Ann Oncol,2011;22(1):93-7.

7Parkin DM,Bray F,Ferlay J,etal.Global cancer statistics,2002〔J〕.CA Cancer J Clin,2005;55(2):74-108.

8Bonaccorsi I,Cantoni C,Carrega P,etal.The immune inhibitory receptor LAIR-1 is highly expressed by plasmacytoid dendritic cells and acts complementary with NKp44 to control IFNα production〔J〕.PLoS One,2010;5(11):e15080.

9Meyaard L.The inhibitory collagen receptor LAIR-1 (CD305)〔J〕.J Leukoc Biol,2008;83(4):799-803.

10Tang X,Tian L,Esteso G,etal.Leukocyte-associated Ig-like receptor-1-deficient mice have an altered immune cell phenotype〔J〕.J Immunol,2012;188(2):548-58.

11薛江楠，王春艷，張曉姝，等.腫瘤患者外周血中抑制性受體LAIR-1表達升高〔J〕.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2008;24(4)：373-4.

〔2015-03-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)