轉(zhuǎn)染T-bet鼻咽癌細(xì)胞腫瘤疫苗的體外抗腫瘤效應(yīng)中干擾素-γ的表達(dá)

曾友根朱欠元李寶金1

(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻喉科，江西吉安343000)

摘要〔〕目的研究轉(zhuǎn)染T-bet鼻咽癌細(xì)胞腫瘤疫苗的體外抗腫瘤效果。方法構(gòu)建轉(zhuǎn)染T-bet鼻咽癌細(xì)胞腫瘤疫苗，體外培養(yǎng)鼻咽癌患者的外周血淋巴細(xì)胞，用腫瘤疫苗刺激后ELISA檢測(cè)上清中細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ的分泌量。結(jié)果淋巴細(xì)胞+TCV-T-bet組細(xì)胞因IFN-γ的含量24 h、48 h、72 h與淋巴細(xì)胞+培養(yǎng)液組及淋巴細(xì)胞+TCV-CNE-2組相比差異顯著(P<0.01)。結(jié)論表達(dá)T-bet基因的人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2腫瘤疫苗在體外能夠誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕T-bet基因；干擾素-γ；腫瘤疫苗

中圖分類號(hào)〔〕R739.63〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2010GZY0192)

通訊作者：朱欠元(1967-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉疾病研究。

1廣州市第八人民醫(yī)院普通外科

第一作者：曾友根(1980-)，男，主治醫(yī)師，講師，主要從事耳鼻咽喉疾病研究。

腫瘤患者體內(nèi)的抗腫瘤免疫是處于抑制狀態(tài)，Th2型免疫強(qiáng)而Th1型免疫弱，因此目前研究熱點(diǎn)是促進(jìn)抗腫瘤的Th1型細(xì)胞免疫〔1〕。T-bet是Th1特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在Th1細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵作用。本文克隆T-bet基因，構(gòu)建含能表達(dá)T-bet基因的人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2腫瘤疫苗，通過腫瘤疫苗的體外抗腫瘤效應(yīng)，檢測(cè)外周血中Th1的特征性細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)情況，研究T-bet調(diào)控Th1優(yōu)勢(shì)分化的作用。

1材料和方法

1.1主要試劑主要試劑胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自HyClone；淋巴細(xì)胞分離液、干擾素(IFN)-γ試劑盒、十四酸佛波酯(PMA)、離子霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1轉(zhuǎn)染T-bet鼻咽癌細(xì)胞腫瘤疫苗構(gòu)建BglⅡ+SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD18-T-bet，通過瓊脂糖電泳切膠回收T-bet基因片段，將T-bet基因片段克隆入pEGFP-C1的相同酶切位點(diǎn)，然后進(jìn)行鑒定。大量提取質(zhì)粒，凍存于-20℃中備用，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染前1 d，用0.25%胰蛋白酶消化 鼻咽癌CNE-2細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于6孔板中，按(2.5～10)×105個(gè)細(xì)胞/孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。重組質(zhì)粒pEGFP-C1-T-bet和空質(zhì)粒pEGFP-C1用前于4℃下15 000 r/min離心10 min，取250 μl無血清DMEM培養(yǎng)基分別稀釋4 μg重組質(zhì)粒pEGFP-C1-T-bet和空質(zhì)粒pEGFP-C1，混勻并置室溫下孵育15 min。同時(shí)取240 μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋10 μl LipofectamineTM2000，室溫下孵育5 min。混合稀釋的LipofectamineTM 2000和稀釋的質(zhì)粒DNA，室溫孵育20 min。加入上述混合液500 μl，輕輕混勻后置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)5 h。5 h以后吸去含質(zhì)粒DNA的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基2 ml，置5%CO2、37℃、孵箱培養(yǎng)，24 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后加G418 (600 μg/ml)進(jìn)行T-bet陽(yáng)性細(xì)胞篩選，篩選14 d后挑取G418抗性單克隆到12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。長(zhǎng)到足夠的數(shù)量時(shí)，提取其總RNA，RT-PCR檢測(cè)T-bet基因的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染T-bet鼻咽癌細(xì)胞腫瘤疫苗用絲裂霉素C處理后制成瘤苗TCV-T-bet(TCV tumour cell vaccine 腫瘤細(xì)胞疫苗)。

1.2.2鼻咽癌病人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的制備取鼻咽癌患者肝素抗凝靜脈血20 ml，離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，制備單細(xì)胞懸液，洗滌置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 h，取懸浮細(xì)胞，即為淋巴細(xì)胞。

1.2.3鼻咽癌病人PBL與腫瘤疫苗的共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測(cè)鼻咽癌病人PBL與腫瘤疫苗的共培養(yǎng)：將PBL按1×1010/L調(diào)整細(xì)胞濃度鋪于6孔板中，在含有PMA 和離子霉素10%胎牛血清的RPMI 1640條件下培養(yǎng)6 h。分成3組，分別加入培養(yǎng)液、TCV-CNE-2和TCV-T-bet。調(diào)整瘤苗濃度使瘤苗和淋巴細(xì)胞的比例達(dá)到1∶20，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。放入5%CO2、37℃、孵箱中培養(yǎng)24 h，離心收集上清液，ELISA檢測(cè)IFN-γ的分泌量，繼續(xù)收集培養(yǎng)48和72 h上清液，ELISA再次檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1T-bet的RT-PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約1 608 bp，與預(yù)計(jì)T-bet cDNA的大小一致(圖1)。

圖1　RT-PCR擴(kuò)增T-bet基因全長(zhǎng)序列

2.2T-bet轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒把重組表達(dá)載體pEGFP-C1-T-bet轉(zhuǎn)入人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2中，用熒光在10×20倍倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)綠色熒光細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率為78%。同時(shí)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2作對(duì)照(圖2)。

A.未轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-T-bet載體時(shí)(普通光下)；B.轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-T-bet載體后 (熒光下) 圖2　CNE-2轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-T-bet載體在 倒置顯微鏡下的表現(xiàn)(×200)

2.3ELISA檢測(cè)人PBL與腫瘤疫苗的共培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌量淋巴細(xì)胞+TCV-T-bet組共培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量24、48、72 h分別為(28.13±3.42)μg/L、(26.23±4.10)μg/L、(25.83±5.67)μg/L；與淋巴細(xì)胞+培養(yǎng)液組24、48、72 h為(0.17±0.11)μg/L、(0.22±0.10)μg/L、(0.15±0.08)μg/L及淋巴細(xì)胞+TCV-CNE-2組24、48、72 h為(0.22±0.13)μg/L、(0.25±0.17)μg/L、(0.24±0.18)μg/L相比，差異顯著(P<0.01)。

3討論

腫瘤疫苗是近年研究的熱點(diǎn)之一，其作用原理是通過激活自身免疫系統(tǒng)，利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，阻止腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，以達(dá)到清除或控制腫瘤細(xì)胞?；蛐揎椀哪[瘤細(xì)胞能使機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，毒性最小。本研究從外周血中分離出淋巴細(xì)胞，擴(kuò)增T-bet分子基因片段，酶切后構(gòu)建入pEGFP-C1真核表達(dá)載體中，通過該載體轉(zhuǎn)染到人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2中，制備轉(zhuǎn)染了基因的鼻咽癌細(xì)胞腫瘤疫苗。一方面通過基因調(diào)控可以改變患者細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，從而刺激機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫；另外利用鼻咽癌細(xì)胞疫苗含有特異性的、具有免疫原性的腫瘤抗原，可以增強(qiáng)其識(shí)別鼻咽癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的能力，從而激活淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生有效的抗癌免疫反應(yīng)。

Th1/Th2分化失衡是機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近來研究〔2，3〕發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)免疫失衡出現(xiàn)Th1/Th2的偏移，Th1因子如IFN-γ明顯降低，IL-4、IL-10等Th2型細(xì)胞因子明顯增多與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和轉(zhuǎn)歸有密切的關(guān)系。因此促進(jìn)抗腫瘤的Th1型細(xì)胞免疫是一個(gè)研究熱點(diǎn)〔4～6〕。T-bet基因是Th1特異性的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控Th1細(xì)胞分化。本文克隆T-bet基因，構(gòu)建含能表達(dá)T-bet基因的人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2瘤苗。使患者外周血CD4+Th細(xì)胞原來的Th2極化型轉(zhuǎn)變?yōu)門h1極化型，增加Th1細(xì)胞的數(shù)量，恢復(fù)Th1/Th2平衡。本試驗(yàn)說明瘤苗作用于淋巴細(xì)胞，可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)IFN-γ。人鼻咽癌細(xì)胞T-bet腫瘤疫苗體外有效的抗腫瘤作用，有望為腫瘤的治療開辟一條新的途徑。但體內(nèi)體外作用的具體機(jī)制和通路有待于進(jìn)一步探討。

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〔2014-04-21修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)