瑣瑣葡萄多糖對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

袁芳徐琦盛磊劉濤1

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011)

摘要〔〕目的探討瑣瑣葡萄多糖(VTP)對β淀粉樣蛋白(Aβ25～35)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。方法Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立阿爾茨海默病(AD)細(xì)胞模型，VTP(20、40、80 mg/L)作用于細(xì)胞模型，CCK-8法檢測各組細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達(dá)。結(jié)果VTP可提高PC12細(xì)胞活性，降低細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)Bcl-2 mRNA表達(dá)，抑制Bax mRNA表達(dá)。結(jié)論VTP對Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)Bcl-2 mRNA表達(dá)、降低Bax mRNA表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默??；瑣瑣葡萄多糖；PC12細(xì)胞； Aβ25～35；細(xì)胞凋亡

中圖分類號〔〕R965.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)

通訊作者：劉濤(1974-)，女，博士，教授，主要從事食品毒理研究。

1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

第一作者：袁芳(1976-)，女，博士，副教授，主要從事維吾爾藥物的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

The effects of polysaccharides from Vitis viniferal L on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35

YUAN Fang,XU Qi,SHENG Lei,etal.

College of Basic Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate protective effects of polysaccharide from Vitis viniferal L(VTP) on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35.MethodsAlzheimer's disease(AD) cellmodel was established by Aβ25～35 inducing PC12 cells,then,the cells were divided into control,model(20 μmol/L Aβ25～35) and VTP groups(20,40,80 mg/L).Cell viability was detected by CCK-8 method.The apoptotic rates were examined by Annexin V-FITC.The mRNA expressions of Bcl-2 and Bax were quantified by real-time PCR.ResultsCompared with that of model group,cell viability was improved,the apoptotic rate was reduced in VTP groups(P<0.05),while the expression of Bcl-2 was increased and Bax expression was decreased(P<0.05).ConclusionsVTP inhibits apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35,which might be involved adjust Bcl-2 and Bax gene expression in the mechanism of anti-apoptosis.

【Key words】Alzheimer's disease；VTP；PC12 cells；Aβ25～35；Apoptosis

隨著對阿爾茨海默病(AD)研究的深入，天然藥物預(yù)防和治療AD的作用日益受到重視。國內(nèi)外研究顯示，葡萄提取物能預(yù)防老年癡呆，對原花青素、白藜蘆醇等葡萄提取物的抗癡呆作用報道較多〔1,2〕?，崿嵠咸?Vitis vinifera L)主產(chǎn)于新疆吐魯番、和田等地，是《神農(nóng)本草經(jīng)》《維吾爾藥志》等醫(yī)藥文獻(xiàn)記載的藥用葡萄品種。本課題組從瑣瑣葡萄提取了多糖、黃酮、三萜等活性物質(zhì)，研究其抗突變、抗氧化、抗病毒、抗衰老等作用〔3〕。本研究擬探討瑣瑣葡萄多糖(VTP)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑VTP按照專利方法(發(fā)明專利200710201354)提取分離，劉濤教授饋贈。DMEM培養(yǎng)液溶解，0.22 μm尼龍濾膜過濾除菌，-20℃避光保存，實驗時用完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。Aβ25～35(Sigma公司，超純水溶解Aβ25～35，置于37℃老化7 d)；DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Trizol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量試劑(Invitrogen)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BioVision)。

1.2儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，垂直流超凈化臺(美國Thermo公司)，全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(BD LSRⅡ)，PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems)，Real Time PCR System 7700型(美國ABI公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞(高分化)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM高糖培養(yǎng)基，含10%滅活胎牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素，置培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2飽和濕度)，隔天換液，3～4 d傳代。

1.3.2CCK-8法測定細(xì)胞活性對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，5×104ml接種于96孔板，100 μl/孔。設(shè)對照組、模型組、VTP實驗組。培養(yǎng)至貼壁后，實驗組加入VTP，使其終濃度為20、40、80 mg/L。預(yù)處理4 h后，除對照組外，其余各孔加入Aβ25～35，使之終濃度為20 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。在酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度，計算PC12細(xì)胞存活率。每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡按上述方法分組，培養(yǎng)細(xì)胞接種于6孔板，消化各組細(xì)胞后收集，1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞沉淀用冷DMEM洗滌2次，在緩沖液中重懸成單細(xì)胞懸液，室溫下加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染料，輕輕振蕩、混勻，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.3.4Real-time PCR檢測Bcl-2和Bax基因表達(dá)按上述方法分組，6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計分析RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 加入熒光定量PCR反應(yīng)體系。根據(jù)GenBank序列，引物和探針設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計引物序列。引物序列β-actin：上游引物3′-AGACCTTCAACACCCCAGCC-5′，3′-CGTCAGGCAGCTCATAGCTC-5′，擴(kuò)增長度362 bp；Bax：3′-CGGCGAATTGGAGATGAACTG-5′，3′-GCAAAGTAGAAGAGGGCA ACC-5′，擴(kuò)增長度161 bp；Bcl-2：3′-GTCGCTACCGTCGTGACTT-5′，3′-CAGCCTCCGTTATCCTGGA-5′，擴(kuò)增長度268 bp。經(jīng)過Blast分析，引物序列具有特異性。所用的引物及內(nèi)參照β-actin引物由鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。數(shù)據(jù)采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法處理，計算待測組目的基因相對于對照組的表達(dá)差異倍數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2結(jié)果

2.1VTP對PC12細(xì)胞活性的影響與對照組比較，模型組細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞活性下降(P<0.01)；VTP各實驗組與模型組比較，細(xì)胞活性明顯增加(P<0.05)，呈劑量相關(guān)性。見表1。

2.2VTP對細(xì)胞凋亡的影響對照組細(xì)胞凋亡率為4.58%，模型組細(xì)胞凋亡率(36.8%)明顯升高，加入VTP干預(yù)的各組細(xì)胞與模型組相比，細(xì)胞凋亡率下降，低、中、高劑量組凋亡率分別為17.05%、11.37%、8.96%。

2.3VTP對Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響模型組與對照組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)下降(P<0.01)；VTP各劑量組與模型組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。見表1。

2.4VTP對Bax mRNA表達(dá)的影響模型組與正常組相比，Bax mRNA表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組相比，VTP各劑量組Bax表達(dá)降低(P<0.01)。見表1。

表1　VTP對Aβ 25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活性及

與對照組相比：1)P<0.01；與模型組相比：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

Aβ是老年斑的主要成分，AD發(fā)病的起始因素是大腦中Aβ的沉積和聚集，發(fā)病機(jī)制與Aβ的神經(jīng)毒性作用密切相關(guān)〔4〕。在AD動物模型及細(xì)胞模型研究中，Aβ25～35誘導(dǎo)損傷建立AD模型是常用方法〔5，6〕。本研究采用20 μmol/L Aβ25～35作用于PC12細(xì)胞24 h構(gòu)建AD體外模型。實驗結(jié)果表明，模型組細(xì)胞活性下降，細(xì)胞凋亡率顯著增加，顯示造模成功，故此模型可以作為評價VTP保護(hù)作用的AD細(xì)胞模型。

從肉蓯蓉、枸杞、黃芪、靈芝等傳統(tǒng)益智中藥中提取的水溶性多糖均具有顯著的改善學(xué)習(xí)記憶功能；海洋貝類中提取的多糖也具有神經(jīng)保護(hù)活性〔7，8〕?，崿嵠咸阎杏泻枯^高的多糖，具有較強(qiáng)的抗氧化能力〔9〕。本研究表明VTP對Aβ25～35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

神經(jīng)系統(tǒng)病變與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)，在慢性神經(jīng)退行性病變中，包括AD、帕金森病、Huntington舞蹈病等患者，腦組織中大量的神經(jīng)細(xì)胞丟失，其共同的病理機(jī)制是神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。AD的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，誘導(dǎo)異常的細(xì)胞凋亡，可導(dǎo)致神經(jīng)元大量丟失，加重神經(jīng)細(xì)胞病理改變，可導(dǎo)致大腦的學(xué)習(xí)、記憶能力受到影響〔10〕。異常聚集的Aβ對神經(jīng)元具有毒性作用，在體內(nèi)體外均可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，在研究AD的防治作用機(jī)制時，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡已成為重要作用靶點。與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的Bcl-2家族基因主要分為抑制凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl基因，以及促凋亡基因Bax和Bad基因。如果促凋亡和抗凋亡基因或相關(guān)蛋白之間的平衡被打破，可引起異常神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可導(dǎo)致神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能損傷〔11，12〕。本研究結(jié)果顯示，VTP能減少Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示VTP通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)抑制 Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

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〔2014-12-29修回〕

(編輯曲莉)