許冰清，安苗苗，姜可以，徐麗麗，楊海蕓，周明兵

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

花葉矢竹葉綠體psbD基因的克隆與功能分析

許冰清，安苗苗，姜可以，徐麗麗，楊海蕓，周明兵

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

植物葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ是植物進(jìn)行光能轉(zhuǎn)化、水的裂解和釋放氧氣的重要蛋白復(fù)合物，psbD基因編碼光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）作用中心蛋白D2，D2和D1構(gòu)成的異源二聚體上結(jié)合著與電子傳遞有關(guān)的大部分輔助因子和色素分子。以花葉矢竹Pseudosasa japonica f.akebonosuji為材料，提取總DNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）擴(kuò)增psbD基因全長序列（Pj-psbD）。序列分析表明：其開放閱讀框（ORF）為1 059 bp，編碼352個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為39.59 kD，等電點(diǎn)為5.34，有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，有別于高等植物中psbD蛋白普遍存在的5個(gè)跨膜區(qū)。psbD還具備有多個(gè)與光合作用有關(guān)的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測了花葉矢竹葉片3個(gè)不同生長階段和3種葉色中psbD基因的表達(dá)量。分析表明：在花葉矢竹葉片生長發(fā)育時(shí)期，為了滿足葉片生長發(fā)育和葉綠體的形成的需要，psbD基因表達(dá)量逐步提高。研究還發(fā)現(xiàn)：psbD在白葉中的表達(dá)量顯著高于綠葉，這可能與植物的光保護(hù)機(jī)制有關(guān)，降低強(qiáng)光對(duì)白色和部分白葉的光合系統(tǒng)的損傷。圖8表1參25

分子生物學(xué)；花葉矢竹；psbD基因；克??；葉色變異；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

高等植物中進(jìn)行光合作用的4類復(fù)合物均分布于葉綠體類囊體膜中，它們分別是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ），細(xì)胞色素b6f復(fù)合物、光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）以及三磷酸腺苷酶（ATP合酶）［1］。光系統(tǒng)Ⅱ主要分布在垛疊的類囊體膜上，是一種包含P680反應(yīng)中心的光合膜蛋白，由原初電子傳遞組分和20多種蛋白組成。光系統(tǒng)Ⅱ復(fù)合體主要由PSⅡ核心（主要包括D1，D2和細(xì)胞色素b559），核心天線蛋白（CP43和CP47），捕光天線復(fù)合體（LHCⅡ）和放氧復(fù)合體外周蛋白組成［2］。光系統(tǒng)Ⅱ中能進(jìn)行光能轉(zhuǎn)化、水的裂解和釋放氧氣，在光合作用過程中非常重要。psbA和psbD分別編碼光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白D1和D2蛋白。D1和D2蛋白組成二聚體再與PSⅡ反應(yīng)中心色素——葉綠素P680分子結(jié)合，共同構(gòu)成光系統(tǒng)Ⅱ的光化學(xué)反應(yīng)中心。其中的D2蛋白按照同步翻譯-組裝的模型插入類囊體膜［3-4］，并在類囊體膜上跨膜5次，最終形成N端在基質(zhì)、C端在囊腔的跨膜蛋白［5］，D1蛋白以相同方式跨類囊體膜［5-6］。D1和D2蛋白在許多物種中都非常的保守,如高等植物、綠藻、眼蟲和一些細(xì)菌［7］。由D1和D2構(gòu)成兩者組成的異源二聚體上結(jié)合著與電子傳遞有關(guān)的大部分輔助因子和色素分子，如原初電子供體P680，原初電子受體Pheoα，β-胡蘿卜素，4個(gè)輔助Chla分子和1個(gè)非血紅素鐵。D1蛋白上的Tyr161（YZ）和D2蛋白上的Tyr161（YD）充當(dāng)了電子傳遞載體。D1和D2蛋白的D-E連接段分別提供了質(zhì)體醌QB和QA的結(jié)合位點(diǎn)，QA可能通過氫鍵結(jié)合著D2-His215，Ala261和Trp254［8］。D2蛋白代謝周轉(zhuǎn)較慢，但在光抑制條件下速度加快［2］。D2不僅可以穩(wěn)定膜上的光系統(tǒng)Ⅱ復(fù)合體，對(duì)D1蛋白的翻譯及翻譯后水平的調(diào)節(jié)也起到特殊的作用［9］?；ㄈ~矢竹Pseudosasa japonica f.akebonosuji原產(chǎn)于日本，是一種優(yōu)良的珍稀觀賞竹種，株高2 m左右，屬于矮小型混生竹種，由矢竹Pseudosasa japonica自然變異而來，葉片顏色為綠白或白綠色條紋，竹叢優(yōu)美，是重要的園林景觀植物［10］。引種栽培至浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園后，其葉片在生長發(fā)育過程中，產(chǎn)生葉色條紋變異，可呈現(xiàn)綠色、白色、綠白相間條紋。條紋的深淺、形狀和出現(xiàn)個(gè)數(shù)和位置都不穩(wěn)定，還會(huì)隨著栽培條件的變化而變化［11］。經(jīng)長期觀察發(fā)現(xiàn)，來自同一葉芽的葉片，其葉色變化模式是一致的，即如果第1片展開葉為接近純白葉，第2層、第3層以及最后1層葉片展開后葉色也接近純白葉。psbD基因在葉綠體的進(jìn)化過程中變化較小，高度保守［12］。本實(shí)驗(yàn)從花葉矢竹中克隆到psbD基因，對(duì)其序列進(jìn)行了分析，并提取花葉矢竹總RNA，用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR），分析psbD基因在不同葉色、不同生長時(shí)期的表達(dá)情況，探討了花葉矢竹葉色變異與光合系統(tǒng)psbD基因的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 植物材料和主要試劑

psbD基因克隆的實(shí)驗(yàn)材料為花葉矢竹（由日本引種栽培于浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園）生長良好的幼嫩葉片。選取3種葉色類型，包括全綠葉（green，G），綠白相間條紋葉（green and albino，GA，1片葉子上綠和白各占約50%）和全白葉（albino，A）。每個(gè)類型的葉片各取了來自同一葉芽的3層葉片，即未暴露葉（S1），卷曲暴露葉（S2）和全展開葉（S3），總共有9個(gè)樣品（圖1），用于熒光定量PCR分析。

AT克隆pMD18-T Vector，Taq酶購自TaKaRa公司，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司的。轉(zhuǎn)化用的大腸埃希菌Escherichia coli，DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNeasy Mini Kit和RNase-Free DNase Set試劑盒購自QIAGEN公司。SYBR Premix Ex TapTMⅡ（Tli RNaseH Plus）和PrimeScriptTM Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒購至于TaKaRa公司。根據(jù)毛竹Phyllostachys edulis的 Actin基因設(shè)計(jì)引物，作為內(nèi)參［13］，用于熒光定量PCR分析。PCR引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

圖1 花葉矢竹Figure 1 Pseudosasa japonica f.akebonosuji samplings

1.2 方法

1.2.1 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取花葉矢竹總DNA 選取生長良好的花葉矢竹幼嫩葉片，用CTAB法［14］提取花葉矢竹總DNA，用于psbD基因的克隆。

1.2.2 PCR擴(kuò)增psbD保守區(qū)域 根據(jù)已報(bào)道的psbD序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了1對(duì)引物（psbD-J-5，psbD-J-3，表1）。以花葉矢竹DNA為模板，PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液（無鎂離子Mg2+）2.0 μL，氯化鎂（25 mmol·L-1）1.2 μL，引物各 0.8 μL，TaKaRa Taq 0.1 μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP）1.6 μL，DNA模板1.0 μL，滅菌蒸餾水12.5 μL，總反應(yīng)體積20.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；然后按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：94℃30 s，50℃30 s，72℃90 s，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后，72℃，10 min，以確保新生鏈延伸完全。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g·kg-1TAE瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。采用上海生工生物工程公司膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，與PMD18-T載體連接，將PCR連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h后涂板［含氨芐西林（Amp）的Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB）平板］，37℃培養(yǎng)12～16 h，直至出現(xiàn)單菌落，用槍頭挑取單克隆至裝有1.0 mL LB培養(yǎng)液（含Amp）的1.5 mL離心管中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)2～4 h。取1.0 μL菌液，用引物PsbD-J-5和PsbD-J-3驗(yàn)證，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；然后按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：94℃30 s，55℃30 s，72℃110 s，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后，72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10.0 g·kg-1TAE瓊脂糖凝膠電泳，將檢測正確的陽性克隆菌液于-70℃保存，并送Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 PCR擴(kuò)增psbD基因全長序列 將獲取的psbD保守區(qū)域片段與已報(bào)道的竹子葉綠體基因組比對(duì)［15］，設(shè)計(jì)了1對(duì)引物（PsbD-F-5，PsbD-F-3，表1）。以花葉矢竹DNA為模板，PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液（無鎂離子Mg2+）2.0 μL，氯化鎂（25 mmol·L-1）1.2 μL，引物各 0.8 μL，TaKaRa Taq 0.1 μL，dNTP 1.6 μL，DNA模板 1.0 μL，滅菌蒸餾水12.5 μL，總反應(yīng)體積20.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；然后按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：94℃30 s，44℃30 s，72℃80 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，72℃10 min，以確保新生鏈延伸完全。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為10.0 g·L-1TAE瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。采用上海生工生物工程公司膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，與PMD18-T載體連接，將PCR連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單克隆，用引物PsbD-F-5和PsbD-F-3進(jìn)行PCR菌檢，連接、轉(zhuǎn)化與菌檢過程同1.2.2。將檢測正確的陽性克隆菌液于-70℃保存，并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

表1 PsbD的PCR的引物序列Table 1 PsbD PCR primers sequences

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR分析 根據(jù)試劑盒說明書提取花葉矢竹各個(gè)樣品的總RNA。所提取的總RNA的濃度采用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000測定，并用質(zhì)量濃度為10.0 g·L-1的瓊脂糖凝膠檢測。根據(jù)所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，10.0 μL的體系，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。包括2.0 μL的5×Prime-Script RT Master Mix（Perfect Real Time），總RNA的量最大到500 ng，最后用沒有RNA酶污染的水（RNase Free dH2O）將總體系加到10.0 μL。輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：37℃15 min，85℃5 s，4℃。得到的cDNA用于下一步的RT-PCR反應(yīng)的模板。其反應(yīng)體系為10.0 μL體系，包括0.8 μL的反轉(zhuǎn)錄的cDNA，5.0 μL的2×SYBR Green I Mastermix，各0.4 μL的上下游引物（引物序列見表1，濃度為10.0 μmol·L-1），加雙蒸水至反應(yīng)總體積為10.0 μL，所有的樣品均重復(fù)3次；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。RT-PCR使用的是CFX96TM Real-Time System儀器。

1.2.5 psbD基因全長序列分析 通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）ORF-finder（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）來鑒定序列的開放讀碼框（ORF）；核苷酸和氨基酸序列的同源性在 DNAStar，MAGE 5.0等軟件完成；用Protparam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）和DNAStar分析氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；通過blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#）獲取蛋白序列的功能結(jié)構(gòu)域信息；通過TMHMM（version2.0）（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析蛋白的跨膜區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 花葉矢竹總DNA的提取

采用CTAB法提取花葉矢竹總DNA，測得DNA樣品光密度D（λ）為324.5 mg·L-1。將提取到的DNA作為模板，于-20℃冰箱保存，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.2 PCR擴(kuò)增psbD保守區(qū)域

以花葉矢竹葉綠體DNA為模板，以psbD-J-5和psbD-J-3為引物，PCR擴(kuò)增psbD保守區(qū)域，測序結(jié)果表明：克隆到的片段大小為1 046 bp。通過NCBI上Blast比對(duì)，結(jié)果表明：擴(kuò)增片段為psbD 3′端部分序列，因此命名為psbD-P（圖2）。

2.3 psbD基因全長的克隆

以花葉矢竹葉綠體DNA為模板，以psbD-J-5和psbD-J-3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為10 g·L-1TAE的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后，在1 125 bp左右有亮帶（圖3），與預(yù)測的基因片段1 062 bp大小相符，初步確定為目的基因片段。測序結(jié)果表明，插入片段大小為1 062 bp（圖4），包含完整的psbD序列，命名為Pj-PsbD。

圖2 花葉矢竹psbD-P基因片段電泳檢測圖Figure 2 Electrophoresis of the amplification fragment of PjpsbD-P gene of Pseudosasa japonica f.akebonosuji

圖3 花葉矢竹psbD基因電泳檢測圖Figure 3 Electrophoresis of the amplification fragment of PjpsbD gene of of Pseudosasa japonica f.akebonosuji

2.4 psbD基因和編碼蛋白序列分析

用DNAStar軟件和NCBI的Blast在線軟件分析測序結(jié)果，該基因開放閱讀框（ORF）的核酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列如圖4所示。結(jié)果表明：花葉矢竹psbD基因序列含有1個(gè)1 059 bp的開放閱讀框（ORF），編碼352個(gè)氨基酸。用Protparam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）進(jìn)行基因序列編碼的蛋白質(zhì)分析預(yù)測。該蛋白氨基酸相對(duì)分子質(zhì)量為39.59 kD，理論等電點(diǎn)為5.34，不穩(wěn)定系數(shù)約為41.13。

圖4 psbD編碼區(qū)核酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列Figure 4 Nucleotide and predicted amino acid sequence of psbD

用TMHMM（version2.0）（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)域，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示出含有6個(gè)跨膜區(qū)（圖5），這與高等植物中己經(jīng)證實(shí)的5個(gè)跨膜區(qū)有差別［5-6］。

psbD氨基酸序列包含有6個(gè)蛋白接口，13個(gè)功能域，其中相關(guān)的功能域見圖6。6個(gè)蛋白接口分別為：蛋白J接口，蛋白H接口，蛋白X接口，蛋白L接口，蛋白T接口，蛋白M接口。13個(gè)功能域分別是：D1界面，葉綠素結(jié)合位點(diǎn)，脫鎂葉綠素結(jié)合位點(diǎn)，β-胡蘿卜素的結(jié)合位點(diǎn)，細(xì)胞色素b559 β界面，醌結(jié)合位點(diǎn)，細(xì)胞色素b559 α界面，核心的捕光蛋白界面，CP43界面，鐵離子結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的，錳穩(wěn)定多肽的界面，溴的結(jié)合位點(diǎn)和細(xì)胞色素c-550界面。

資料表明：由D1和D2構(gòu)成兩者組成的異源二聚體上結(jié)合著與電子傳遞有關(guān)的大部分輔助因子和色素分子，如原初電子供體P680，原初電子受體Pheoα，β-胡蘿卜素，4個(gè)輔助Chla分子和1個(gè)非血紅素鐵。D1蛋白上的Tyr161（YZ）和D2蛋白上的Tyr161（YD）充當(dāng)了電子傳遞載體。D1和D2蛋白的D-E連接段分別提供了質(zhì)體醌QB和QA的結(jié)合位點(diǎn)，QA可能通過氫鍵結(jié)合著D2-His215，Ala261和Trp254［8］。

圖5 psbD基因編碼蛋白的跨膜區(qū)域Figure 5 psbD genes encoding amino acid sequence across the membrane area

用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因數(shù)據(jù)庫，對(duì)獲得的PjpsbD基因序列進(jìn)行了同源性分析，結(jié)果表明：Pj-psbD基因編碼的蛋白與其他物種的psbD基因有著較高的相似性（圖6），與玉米Zea mays中的Zm-psbD一致性達(dá)95%，與日本晴Oryza sativa subsp．japonica的OsJ-psbD一致性達(dá)98%，與秈稻O.sativa subsp.indica中的OsI-psbD一致性達(dá)98%，與大豆Glycine max中的Gm-psbD一致性達(dá)97%。

2.5 進(jìn)化樹分析

通過MAGE 5.0運(yùn)用Neighbor-Joining方法構(gòu)建不同物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。對(duì)Pj-psbD基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖7），對(duì)比毛竹（YP004733564.1），水稻Oryza sativa（AAS46108.1），高粱Sorghum bicolor（YP899392.1），粟 Foxtail millet（AHV90309.1），二穗短柄草 Brachypodium distachyon（B3TNB8.1），玉米（NP 043009.1），花葉矢竹與毛竹中的psbD基因親緣關(guān)系較近，其次和水稻的psbD基因。

2.6 psbD熒光定量PCR分析

圖6 psbD基因編碼蛋白的多序列比對(duì)Figure 6 Alignment analysis of amino acid sequences encoded by psbD

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0 g·kg-1的瓊脂糖凝膠檢測提取的RNA結(jié)構(gòu)完整，可以用于定量PCR分析。由熔解曲線來檢驗(yàn)引物特異性，產(chǎn)物沒有引物二聚體或其他非特異性擴(kuò)增，該引物可用來檢測基因表達(dá)量。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，以Actin做為內(nèi)參，psbD在花葉矢竹9個(gè)樣品中的表達(dá)量如圖8。結(jié)果顯示：在全綠葉（G）中，psbD的表達(dá)量在全展開葉期（S3）最低，其次是卷曲暴露葉期（S2），表達(dá)量最高的是未暴露葉期（S1）；綠白相間條紋葉（GA）和全白葉（A）中psbD基因在S3期的表達(dá)量也是最低，S1和S2期的表達(dá)最高。對(duì)應(yīng)的同一個(gè)發(fā)育階段中，A葉片的表達(dá)量最高，G葉片表達(dá)量最低，即隨著葉片綠色部分體積的減小，基因psbD的表達(dá)量逐漸上升。

圖7 psbD基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 7 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequences encoded by psbD

3 討論

用CTAB法提取植物葉片DNA，會(huì)得到葉片中所有的DNA，總DNA里包括葉綠體DNA，使用這種模板可以進(jìn)行葉綠體和線粒體基因組上的擴(kuò)增。所以，可以用CTAB法提取的植物葉片的DNA中擴(kuò)增出psbD基因。葉綠體DNA（chloroplast DNA，cpDNA）屬母性遺傳，相對(duì)于核基因組，具有分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，序列保守，突變率較低，遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)［16］。大多數(shù)高等植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，基因數(shù)量、排列順序及組成上具有保守性［17］。psbD基因在葉綠體的進(jìn)化過程中變化較小，高度保守。由psbD基因構(gòu)建的進(jìn)化樹表明花葉矢竹與毛竹中的psbD基因親緣關(guān)系較近，其次和水稻的psbD基因，但與玉米的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。部分分子證據(jù)也表明，竹亞科 Bambusoideae和稻亞科 Ehrhartoideae有最近的親緣性和最相似的基因序列結(jié)構(gòu)［18-19］，在在早期的禾本科Gramineae分類中，水稻曾被分在竹亞科之下，與竹類植物分?jǐn)?shù)不同的族［20］。

圖8 psbD反轉(zhuǎn)錄RT-PCR在花葉矢竹不同組織不同時(shí)期的表達(dá)量Figure 8 Expression level of psbD in various organs of Pseudosasa japonica f.akebonosuji at different developmental stages

光照能促進(jìn)葉綠體的形成。在個(gè)體發(fā)育中葉綠體由原質(zhì)體發(fā)育而來，原質(zhì)體存在于根和芽的分生組織中，由雙層被膜包圍，含有DNA、一些小泡和淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)，但不含片層結(jié)構(gòu)，小泡是由質(zhì)體雙層膜的內(nèi)膜內(nèi)折形成的。在有光條件下原質(zhì)體的小泡數(shù)目增加并相互融合形成片層，多個(gè)片層平行排列成行，在某些區(qū)域增殖，形成基粒，變成綠色原質(zhì)體發(fā)育成葉綠體。在黑暗性長時(shí)，原質(zhì)體小泡融合速度減慢，并轉(zhuǎn)變?yōu)榕帕谐删W(wǎng)格的小管的三維晶格結(jié)構(gòu)，稱為原片層，這種質(zhì)體稱為黃色體。黃色體在有光的情況下原片層彌散形成類囊體，進(jìn)一步發(fā)育出基粒，變?yōu)槿~綠體。

PSⅡ復(fù)合體是葉綠體重要組成部分，其核心是由2個(gè)結(jié)構(gòu)相似的D1和D2蛋白組成的光反應(yīng)中心，D2蛋白在維持PSⅡ反應(yīng)中心構(gòu)像的穩(wěn)定和電子傳遞方面起重要作用，同時(shí)還參與調(diào)節(jié)D1蛋白表達(dá)［21］。另一方面，有研究結(jié)果表明：從高等植物葉綠體中分離得到的PSⅡ反應(yīng)中心D1對(duì)強(qiáng)光不穩(wěn)定，其中色素分子以及組氨酸殘基會(huì)發(fā)生光照破壞［22-24］，最終導(dǎo)致D1蛋白的降解。研究表明：D2蛋白上非原初電子受體pheo（反應(yīng)中心復(fù)合物中去鎂葉綠素a）對(duì)P680具有保護(hù)作用［25］。因此，葉綠體中的D2蛋白對(duì)PSⅡ的正常工作意義重大。

本實(shí)驗(yàn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測了花葉矢竹3種葉色3種不同生長階段中psbD基因的表達(dá)量，得出成熟葉片（S3）中的表達(dá)量明顯低于生長發(fā)育時(shí)期（S1，S2），而在不同葉色間比較，在全白葉中基因psbD表達(dá)量最高，在全綠葉（G）中的表達(dá)量最低，并且隨著葉片白色部分的增多，psbD基因表達(dá)量逐漸上升。

花葉矢竹葉片處于S1和S2生長發(fā)育階段時(shí)，葉面積變化最顯著，葉片生長最快，為了滿足葉片生長發(fā)育和葉綠體的形成的需要，psbD基因在3種類型的葉片S1和S2表達(dá)量最高，隨著在葉片展開為成熟葉片以后，葉片生長變慢，表達(dá)量明顯降低。在不同葉色間比較，在全白葉（A）中基因psbD表達(dá)量最高，這可能是不同葉色的葉片應(yīng)對(duì)強(qiáng)光對(duì)光合系統(tǒng)的破壞的一種保護(hù)機(jī)制，因?yàn)樵谕裙庹諚l件下，白葉透光率明顯高于綠葉，白葉的光合系統(tǒng)更容易因光破壞而影響正常功能，D2蛋白上非原初電子受體pheo（反應(yīng)中心復(fù)合物中去鎂葉綠素a）對(duì)P680具有保護(hù)作用，因此，白葉中需要psbD高表達(dá)來降低光對(duì)白色和部分白葉的光合系統(tǒng)的損傷［24］，從而表現(xiàn)為在白葉中，psbD基因表達(dá)量最高。

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Cloning and functional analysis of the psbD gene in Pseudosasa japonica f.akebonosuji

XU Bingqing,AN Miaomiao,JIANG Keyi,XU Lili,YANG Haiyun,ZHOU Mingbing
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

PhotosystemⅡ（PSⅡ）of a plant chloroplast is an important protein complex in light-dependent reactions of oxygenic photosynthesis with the psbD gene encoding the center protein D2.Until now,psbD gene in Pseudosasa japonica f.akebonosuji still would not been sequenced and reported.In order to analysis the psbD gene structure and the potential relation of psbD gene function and leaf color variation,in this study the genomic DNA of Pseudosasa japonica f.akebonosuji was extracted and the full-length psbD gene sequence（PjpsbD）was amplified by polymerase chain reaction（PCR）.The expression pattern for Pj-psbD was detected by the fluorescence quantitative PCR technique in three different growth （S1,S2and S3）stages using green,stripe and albino leavesof P.japonica f.akebonosuji leaves with three material replicates and three expriements replicates.Results showed that the Open Reading Frame （ORF）of Pj-psbD was 1 059 bp long encoding 352 amino acids with a relative molecular weight of 39.59 kD and an isoelectric point of 5.34.In the Pj-psbD polypeptide chain,there were six transmembrane domains,plus multiple photosynthesis domains and other function sites.Among the three colors of leaves the psbD expression level in the three growth stages of the albino leaves was highest with more than 2-4 times than those of the according three growth stages of the green leaves.The continuously increasing expression levels of the gene along with leaf growth and development forthe three types of leaves could meet the formation needs of the chloroplast,and the high psbD expression level in the albino leaf could be the protection mechanism that inhibits light damage in the photosynthetic system.［Ch,8 fig.1 tab.25 ref.］

molecular biology;Pseudosasa japonica f.akebonosuji;psbD genes;cloning;leave color variation; quantitative real time-polymerase chain reaction（qRT-PCR）

S795；Q786

A

2095-0756（2015）04-0557-09

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.04.010

2014-09-22；

2014-11-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31170565，31270645,31470615）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LR12C16001,LY12C16002）

許冰清，從事竹類植物基因組進(jìn)化研究。E-mail：349450241@qq.com。通信作者：周明兵，副教授，博士，從事竹類植物基因組進(jìn)化研究。E-mail：zmbin@163.com