本刊記者 孫秋霞 徐芳芳

曾園山：將脊髓損傷修復(fù)研究進行到底

本刊記者 孫秋霞 徐芳芳

曾園山教授在辦公室

隨著我國交通事業(yè)和建筑事業(yè)的高速發(fā)展，交通事故和建筑事故等引起的創(chuàng)傷性脊髓疾病越來越嚴重危害人民的生命健康。其中，急性嚴重的脊髓損傷會導(dǎo)致患者截癱或四肢癱。這種致殘性損傷給患者和家庭帶來極大的痛苦和巨大的經(jīng)濟負擔。在相當長的時間里，國內(nèi)外沒有行之有效的治療方法。

不過，這一現(xiàn)狀可能會得到改觀。中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系教授曾園山正在帶領(lǐng)他的團隊，致力于干細胞移植與脊髓損傷修復(fù)機制的研究。曾園山透露，他們正在尋找修復(fù)脊髓損傷的新策略，弄清其修復(fù)機制，并試圖應(yīng)用于臨床前研究，這必將對創(chuàng)傷性脊髓疾病的有效治療提供強有力的保證。

開創(chuàng)脊髓損傷修復(fù)新方法

梅，素有國花之譽，世人皆傾慕之，以其為州名，遂有“梅州”。始建于秦朝的廣東省梅州市，是曾園山的故鄉(xiāng)，這里景色怡人，人文薈萃，先后培育出兩院院士22名。曾園山是中山大學(xué)組織胚胎學(xué)系主任、博士生導(dǎo)師，從普通家庭學(xué)子到大學(xué)教授，曾園山身上始終有著一股不服輸?shù)膭艃?，不怕吃苦的精神?/p>

在組織學(xué)與胚胎學(xué)領(lǐng)域工作和學(xué)習(xí)了將近37年的曾園山，發(fā)表學(xué)術(shù)論文150篇，其中48篇發(fā)表在SCI收錄的英文期刊上。相繼獲得“嗎啡促進脊髓可塑性變化的研究”國家衛(wèi)生部科技進步三等獎、“人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構(gòu)建方法”和“一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷的明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建”兩項國家發(fā)明專利，使我國在應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)創(chuàng)傷性脊髓病傷研究領(lǐng)域居于國際前列。

從事多年的干細胞移植與脊髓損傷修復(fù)的研究，曾園山有兩個較為滿意的研究成果。

2008年，曾園山和他的研究生所發(fā)明的“人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構(gòu)建方法”獲得國家發(fā)明專利。曾園山告訴記者，應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子治療脊髓損傷是目前研究的熱點之一，所使用的多是神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5(NT-4/5)等。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是能夠支持機體神經(jīng)元存活，促進其生長、分化，及維持其功能的一類化學(xué)因子。它包括NT-3、NGF、BDNF和NT-4/5等。神經(jīng)營養(yǎng)因子對其靶細胞起生物學(xué)作用之前，首先要與靶細胞上的受體結(jié)合。目前已知神經(jīng)營養(yǎng)因子有兩種受體：酪氨酸蛋白激酶受體(高親和力受體)和p75受體(低親和力受體)。酪氨酸蛋白激酶受體是由原癌基因Trk編碼的一種受體, 亦稱為Trk受體。Trk受體又可分為TrkA、TrkB和TrkC 3種。神經(jīng)營養(yǎng)因子與其受體的結(jié)合是有選擇性的。NGF與受體TrkA結(jié)合，BDNF和NT-4/5與受體TrkB結(jié)合，NT-3與受體TrkC結(jié)合?，F(xiàn)有研究表明，NT-3能促使表達TrkC的神經(jīng)干細胞更多地分化為神經(jīng)元。

曾園山解釋道，他們將TrkC基因轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細胞后移植到脊髓損傷處，讓神經(jīng)干細胞過表達NT-3受體，同時一起移植NT-3基因修飾的雪旺細胞，讓轉(zhuǎn)基因雪旺細胞過表達NT-3，更好地促進帶有NT-3受體的神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元，生長出軸突。此方法能在脊髓損傷處形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，起上、下行傳導(dǎo)神經(jīng)信息的橋梁作用，修復(fù)脊髓自主運動功能。這種治療策略，可能會更有效地促進受損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)，為臨床治療脊髓創(chuàng)傷性疾病乃至大腦創(chuàng)傷性疾病提供新方法。

曾園山滿意的第二項成果，是用于修復(fù)脊髓損傷的三維明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建，該項研究成果于2011年獲得國家發(fā)明專利授權(quán)。

在脊髓創(chuàng)傷中，生物組織工程材料作為移植細胞或作為具有保護神經(jīng)元和促進其軸突再生作用的活性因子的載體，逐漸引起人們的關(guān)注。

組織工程材料分為天然來源生物材料、不可降解合成材料和可降解高分子合成材料。天然生物材料做成的凝膠、明膠海綿和膠原海綿，或者用可降解高分子合成材料做成的導(dǎo)管，都可用于橫斷性脊髓損傷修復(fù)。凝膠能夠在脊髓損傷空洞處起填充作用，促進軸突再生，減少星形膠質(zhì)細胞增生形成的疤痕。但是，它不能較好地介導(dǎo)再生軸突穿越損傷區(qū)域，并且缺乏機械強度。導(dǎo)管最大的優(yōu)勢是，它有一定的機械強度，能夠介導(dǎo)再生軸突穿越導(dǎo)管本身，達到橫斷傷脊髓組織的另一端，即起到橋接作用，但有些導(dǎo)管在降解之后產(chǎn)生的酸性物質(zhì)對鄰近細胞有損害作用。

鑒于以上認識，曾園山團隊設(shè)立了發(fā)明的基本方案。“我們以多孔隙明膠海綿為主體，外面應(yīng)用PLGA薄膜包裹，形成一種形貌像圓柱體的支架材料。在此基礎(chǔ)上吸附骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞或雪旺細胞等，構(gòu)建成能夠促進軸突再生的可降解天然生物材料支架。應(yīng)用時，將其移植到橫斷性脊髓損傷處或神經(jīng)損傷處?！贝隧棸l(fā)明為他團隊日后應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)創(chuàng)傷性脊髓病傷奠定了強有力的基礎(chǔ)，現(xiàn)已制備成功干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架，正在研制的類脊髓樣組織支架等。

在2013年中國組織胚胎學(xué)學(xué)術(shù)研討會上介紹醫(yī)學(xué)本科《組織學(xué)與胚胎學(xué)》實驗教學(xué)綜合改革思路與實施

醫(yī)學(xué)教育

“不管從哪里來，都要一步步往上走，哪怕再辛苦也不怕”。曾園山不僅告誡自己，也這樣教育自己的學(xué)生。在科研與教學(xué)中，曾園山總是傾力以赴。他認為，一個好的大學(xué)老師，不僅要傳授專業(yè)知識，還應(yīng)該探索自己感興趣的知識，從而豐富和挑戰(zhàn)專業(yè)知識。

曾園山從事醫(yī)學(xué)教育工作34年了，現(xiàn)在的他，是中山醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系主任、中國解剖學(xué)會常務(wù)理事和廣東省解剖學(xué)會理事長，廣東省重點學(xué)科（人體解剖與組織胚胎學(xué)）的帶頭人，廣東省組織學(xué)與胚胎學(xué)精品課程和廣東省組織學(xué)與胚胎學(xué)資源共享課負責(zé)人。

在醫(yī)學(xué)教育改革中，他遵循“讓學(xué)生邁好堅實的第一步”的宗旨，著重抓好學(xué)生“三基（基礎(chǔ)理論、基礎(chǔ)知識、基礎(chǔ)技能）”的培養(yǎng)。在精品課程建設(shè)中，他有“三個堅持”：堅持集體備課、聽課和教評制度；堅持對青年教師的教學(xué)能力培養(yǎng)；堅持在教師指導(dǎo)下的自學(xué)方式。

在曾園山看來，組織學(xué)與胚胎學(xué)課程是一年級醫(yī)學(xué)生的醫(yī)學(xué)前期基礎(chǔ)課程，為許多后續(xù)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)課程奠定堅實的基礎(chǔ)。在教學(xué)改革中，曾園山根據(jù)該學(xué)科的特點、課程性質(zhì)、授課老師的英語水平、學(xué)生的英語及專業(yè)知識基礎(chǔ)，循序漸進地拓展雙語教學(xué)改革，增強醫(yī)學(xué)生利用英語理解、掌握專業(yè)知識的能力及運用醫(yī)學(xué)專業(yè)英語進行學(xué)術(shù)交流、解決問題的能力。為此，他于2004年申報了中山大學(xué)教學(xué)改革專項研究課題“推進組織學(xué)與胚胎學(xué)雙語教學(xué)培養(yǎng)高素質(zhì)醫(yī)學(xué)人才”，并獲得批準立項。2008年，該項雙語教學(xué)研究成果獲中山大學(xué)優(yōu)秀教學(xué)成果獎一等獎。2012年9月，曾園山被廣東省教育廳等評選為廣東省南粵優(yōu)秀教師。2014年11月，寶鋼教育基金會授予曾園山寶鋼“優(yōu)秀”教師稱號。

曾園山非常重視人才培養(yǎng)的工作。“如果抱著學(xué)生是為我來工作的態(tài)度，就會遇到很多矛盾，應(yīng)該讓他們學(xué)到自己感興趣的東西?！彼J為，作為老師，應(yīng)該愛護和理解學(xué)生，而不是一定要學(xué)生按自己的要求行事，他始終秉持著讓學(xué)生勞有所獲的態(tài)度。曾園山常常和學(xué)生在一起交流討論，很少與學(xué)生發(fā)生矛盾?！叭绻_實不能夠處理好我們之間的矛盾，亦應(yīng)該和氣地分開。我們還是很好的師生，很好的朋友，只是工作方式或?qū)W習(xí)方式不一樣?！痹鴪@山說：“有的同學(xué)到了他們感興趣的其他實驗室，后來發(fā)現(xiàn)還是我處理矛盾的技巧有特色。因為我們經(jīng)常跟美國、香港和新加坡有研究合作，學(xué)生能夠在其中學(xué)到知識。”至今為止，他培養(yǎng)和指導(dǎo)了博士生23名、碩士生29名、8年制醫(yī)學(xué)本科生4名、博士后4名和國內(nèi)訪問學(xué)者1名。

曾園山教授在實驗室

從校醫(yī)到學(xué)者

曾園山出生于廣州，他學(xué)習(xí)勤奮努力，一直讀到高中。那時還未恢復(fù)高考，靠推薦才能上大學(xué)。曾園山一步一個腳印，從許多同齡人中脫穎而出，逐漸實現(xiàn)了自己的目標。

將要高中畢業(yè)那年，曾園山被學(xué)校推薦到廣州市第一人民醫(yī)院衛(wèi)生學(xué)校進行短期培訓(xùn)。一年后，他被分配到當?shù)刂袑W(xué)擔任校醫(yī)工作，需要跟著師生一起到農(nóng)村分校學(xué)農(nóng)。農(nóng)村有許多中草藥，當?shù)氐某嗄_醫(yī)生時常帶他上山采藥，并給他講解這些植物的藥用功效。那時，曾園山便對中草藥治療常見疾病充滿了好奇。

在從事醫(yī)療實踐的過程中，曾園山發(fā)現(xiàn)對一些疾病自己沒辦法去治療。那時，便產(chǎn)生了求學(xué)的熱情。由于工作表現(xiàn)出色，兩年后，他被廣州市主管中學(xué)校醫(yī)工作的部門推薦到廣州醫(yī)學(xué)院攻讀醫(yī)療系?！澳悄?，100多所中學(xué)校醫(yī)只有兩個名額。雖然我比較瘦小，但因平時工作比較賣力，肯動腦子改善師生在農(nóng)村分校的食住、學(xué)習(xí)和工作的衛(wèi)生環(huán)境，給領(lǐng)導(dǎo)和同事們留下了好的印象?！?/p>

大學(xué)期間，曾園山牢記著明確的學(xué)習(xí)目標，成績一直十分優(yōu)異。老師們曾讓他在開門辦學(xué)的課堂上講過兩次課，“由于我有一線的工作經(jīng)驗，在講課的時候就會生動一些”。畢業(yè)后，他被學(xué)校留下當了組織學(xué)與胚胎學(xué)專業(yè)老師，那時他才22歲。

“在大學(xué)教書的時候，還是覺得自己的知識不足，那時候，中山醫(yī)學(xué)院已經(jīng)開始招收研究生，但與他從事的相關(guān)專業(yè)只招一個?！苯?jīng)過幾番考慮，曾園山下定決心要考上研究生。

1980年，曾園山成為中山醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室“文革”后的第一位研究生，師從郭畹華教授，研究神經(jīng)生長因子對體外培養(yǎng)神經(jīng)元突起生長機制的影響。那時，他是班里年紀較小的一個，大家選舉他做生活委員，為班上同學(xué)們服務(wù)。碩士研究生畢業(yè)后，在中山醫(yī)科大學(xué)當講師的曾園山仍不滿足現(xiàn)有的知識儲備，于是他考上華西醫(yī)科大學(xué)(現(xiàn)四川大學(xué))攻讀博士研究生，師從吳良芳教授，研究嗎啡對脊髓可塑性的影響。1998年，他的“嗎啡促進脊髓可塑性變化的研究”獲國家衛(wèi)生部科技進步獎三等獎。

1999年，鞠躬院士負責(zé)國家重點基礎(chǔ)研究項目（973）“脊髓損傷修復(fù)的研究”?！爱斘覀兊弥@個消息后，立刻趕到西安第四軍醫(yī)大學(xué)鞠躬院士的辦公室，希望能夠一起來參與這個研究課題。最終我們得到了這個機會，心里非常高興。”雖然經(jīng)過幾年探索，曾園山團隊的研究進展并不盡如人意?！爱斘覀兣c中國脊髓損傷網(wǎng)機構(gòu)的國內(nèi)、外專家交流時，發(fā)現(xiàn)僅僅移植細胞解決不了脊髓損傷修復(fù)的關(guān)鍵問題。如果我們能從其他角度來研究，也許會有另一番天地。”基于以上認識，曾園山帶領(lǐng)研究團隊繼續(xù)摸索?！昂髞砦覀儼l(fā)現(xiàn)，如果在體外三維支架材料里面形成干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)去移植，可能效果比前期更好?！?/p>

“熟悉我的人說，曾園山是老樹發(fā)新芽，我覺得形容得非常貼切?！痹鴪@山總結(jié)道，前期的工作都是為后來奠下基礎(chǔ)，盡管前期工作看似毫無結(jié)果，但不到最后誰也不知道答案。

團隊合影

壯心不已

60歲的曾園山計劃在5年后退休?！爸猩酱髮W(xué)規(guī)定博士生導(dǎo)師可以工作到60歲或65歲，我覺得60歲退休有點過早?！备鶕?jù)國家以往的政策，曾園山如果現(xiàn)在退休，可以享受更多的福利?！凹词?5歲不會有這樣的福利，我也有精神上的回報，還可以在這個領(lǐng)域做更多的事情?！?/p>

從2014年開始，曾園山擔任國家自然科學(xué)基金重點項目“干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架移植修復(fù)脊髓受損傷神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機制研究”的項目負責(zé)人。脊髓內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由其中的的中間神經(jīng)元聯(lián)絡(luò)上、下行傳導(dǎo)信息的神經(jīng)纖維以及運動神經(jīng)元等元件構(gòu)成，脊髓損傷的結(jié)果是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的解體，導(dǎo)致神經(jīng)元之間形成的環(huán)路功能喪失；同時也會導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡、脊髓損傷處的神經(jīng)營養(yǎng)因子下調(diào)以及神經(jīng)生長抑制因子上調(diào)。曾園山告訴記者，嚴重的脊髓損傷不可能依靠自身再生修復(fù)，因為里面的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)已被破壞，需要借助人為干預(yù)幫助其結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)?！氨M管嘗試了許多辦法來解決神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)損傷修復(fù)的問題，但最終還是失敗了?！痹谂c同事們的討論中，曾園山亦感覺到任何單一因素的治療措施，如單純地移植細胞或是給予藥物，都不能夠有效地促使受損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)?！拔覀冋J為，應(yīng)該利用現(xiàn)代最新的再生醫(yī)學(xué)手段來進行修復(fù)，就有可能解決脊髓損傷處的微環(huán)境不利于其自身重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)這一關(guān)鍵科學(xué)問題?！?/p>

在前期研究的基礎(chǔ)上，他們依據(jù)脊髓主要功能是傳導(dǎo)上、下行神經(jīng)信息和進行反射活動的特點，綜合性運用神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體、成體干細胞和生物支架材料等再生醫(yī)學(xué)技術(shù)，在體外構(gòu)建一種具有突觸傳遞功能的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架，然后將其移植到全橫斷脊髓損傷處，在脊髓內(nèi)起到修復(fù)受損傷神經(jīng)傳導(dǎo)通路的中繼站作用。曾園山解釋道，這可以使原本癱瘓的肢體具有自主運動功能，加上康復(fù)訓(xùn)練，為臨床治療脊髓損傷提供應(yīng)用基礎(chǔ)研究依據(jù)。

在原來研究的基礎(chǔ)上，曾園山想把干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架變成像脊髓一樣的組織，這樣修復(fù)和替換效果可能會更好。曾園山解釋道，把體外干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架建成類似自然條件下的脊髓組織，這肯定沒有在自然條件下形成的脊髓組織結(jié)構(gòu)那樣精細，那樣功能完整。這項研究工作正處于初始階段，但他們已經(jīng)看到了一些曙光。“我們已經(jīng)在體外構(gòu)建類脊髓樣組織看到了一些成效，將來如果在猴子身上實驗成功，就有可能嘗試用在人身上?！?/p>

最近，作為中山醫(yī)學(xué)院一方，曾園山與中山大學(xué)化工學(xué)院的全大萍教授合作，將利用3D打印技術(shù)和生物墨水，打印出脊髓組織細胞外基質(zhì)的支架材料。曾園山告訴記者，全大萍教授是做高分子材料的，如果生物墨水的配方配制得好，就能打印出豬的脊髓支架，甚至有可能打印出人的脊髓支架?！拔覀冊谥Ъ苌戏N植細胞，把它做成類脊髓樣組織，進行臨床前的研究就有了可靠的基礎(chǔ)”。

曾園山希望研究團隊能夠在干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、類脊髓樣組織等方面有所建樹。此外，他還希望能夠在生命科學(xué)生物組織工程領(lǐng)域嘗試一番，得到專家的認可。目前，一名“青年千人”愿意加盟到他的學(xué)科中，曾園山希望在退休之前好好培養(yǎng)他，讓他在3到5年能夠熟悉組織學(xué)與胚胎學(xué)課程的教學(xué)及其學(xué)科建設(shè)工作。