青蛤(Cyclinasinensis)IRAK-4基因的克隆及其組織間的表達分析

楊 瑩，高 珊，潘寶平*，鄭津輝，高 虹

(天津師范大學生命科學學院天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387)

摘要利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得了青蛤(Cyclina sinensis)白介素-1受體相關(guān)激酶-4(Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4)基因的序列信息，利用巢式及熒光定量PCR克隆并分析了CsIRAK-4基因在青蛤各組織中的表達情況，進一步在鰻弧菌的脅迫下檢測了CsIRAK-4基因在青蛤血淋巴中的時序表達情況。結(jié)果顯示，CsIRAK-4基因的序列全長共2 687 bp，其開放閱讀框長1 926 bp，共編碼641個氨基酸，CsIRAK-4基因在青蛤的血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、性腺和鰓中均表達，其中在血淋巴中表達量最高，肝臟中表達量最低。青蛤在鰻弧菌脅迫下該基因的表達量在3 h即達到最大值，與對照組差異極顯著(P<0.01)，證明該基因所表達的產(chǎn)物是青蛤重要的免疫信號通路蛋白。

關(guān)鍵詞青蛤；轉(zhuǎn)錄組文庫；熒光定量PCR；CsIRAK-4

中圖分類號S917

基金項目天津市科委應用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)重點項目(12JCZDJC22800；14JCZDJC34200)。

作者簡介楊瑩(1992-)，女，天津人，碩士研究生，研究方向：分子免疫與分子系統(tǒng)學。*

收稿日期2015-08-05

Cloning and Expression of IRAK-4 inCyclinasinensis

YANG Ying, GAO Shan, PAN Bao-ping*et al(Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387)

AbstractThe sequence of Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 in Cyclina sinensis was obtained by build the transcriptome library, the expression in some organisations from Cyclina sinensis was analyzed by Nested-PCR and RT-PCR, and the expression of CsIRAK-4 in haemolymph after stimulated was studied by vibrio anguillarum. The result showed that the sequence length of CsIRAK-4 are consisted of 2 687 bp, the open reading frame are 1 926 bp and encoding 641 amino acids. The CsIRAK-4 was expressed in haemolymph, liver, coat film, closed shell, gonad and gill, and the expression level of CsIRAK-4 in its haemolymph was the highest and in the liver was the lowest. After stimulated by vibrio anguillarum, the expression level increased obviously and reached to the max at 3 h, and has a very significantly difference with the control group (P<0.01), this resulte proved that the product of the gene expressed was an important immune signaling pathways protein in Cyclina sinensis.

Key wordsCyclinasinensis; Transcriptome library; Real-time quantitative PCR; CsIRAK-4

青蛤(Cyclinasinensis)是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類，棲息于富于泥沙、泥漿的沿海潮汐地帶，廣泛分布于東海、黃海、南海等地[1]。青蛤的營養(yǎng)價值豐富，肉質(zhì)鮮美，且其生長周期短，耐鹽性好，存活率高，在離水后可較長時間生存[2-3]，對于不良生存環(huán)境有較好的抵御能力[4-5]。近年來，青蛤增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的擴大及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導致青蛤的病害連年發(fā)生，使該項產(chǎn)業(yè)受到嚴重威脅[6-8]。因此對于青蛤免疫抗病害研究具有重要的實踐意義。

貝類屬于非特異性免疫系統(tǒng)，其中Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是非特異性免疫反應中一類重要的識別受體，在對抗病原物的侵染過程中起著關(guān)鍵作用[9-14]。白介素-1受體相關(guān)激酶(Interleukin-1 receptor-associated kinases，IRAKs)是TLRs信號通路中的重要成員之一[9，15]。其中白介素-1受體相關(guān)激酶-4(Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4)是IRAKs家族中最后發(fā)現(xiàn)的一個成員[16-17]。IRAK-4基因與IRAKs家族中其他基因結(jié)構(gòu)相似，但缺少一個C端結(jié)構(gòu)域，且行使功能時需要利用其自身激酶的活性[18-19]。研究表明，IRAK-4基因與細胞免疫過程中T細胞受體的識別過程密切相關(guān)[20]，這表明，先天免疫系統(tǒng)與適應性免疫系統(tǒng)之間有著錯綜復雜的聯(lián)系，而IRAK-4基因在兩者之間起著媒介作用。由此可見，IRAK-4基因在機體的免疫過程中至關(guān)重要。

目前，IRAK-4基因在脊椎動物中的相關(guān)研究較多，而在無脊椎動物中研究極少，僅在長牡蠣(Crassostreagigas)和雜色鮑(Haliotisdiversicolor)中有相關(guān)報道。在與青蛤同源性最高的雜色鮑中，IRAK-4基因在各個組織中均表達[9]。目前并未發(fā)現(xiàn)IRAK-4基因在青蛤中的相關(guān)研究，該研究在提高青蛤免疫能力及探索其抗病害機理方面具有重要的理論意義。

1材料與方法

1.1材料青蛤樣品采集于天津大港灘涂，暫養(yǎng)于人工通氣海水中，海水密度1.02～1.04 g/cm3，水溫21～24 ℃，pH 7.0，投喂5‰小球藻。飼養(yǎng)7 d后，選取表面無破損，形態(tài)上無顯著差異的個體[平均殼寬(19.12±0.57)mm，平均殼長(29.14±1.23)mm，平均殼高(29.52±1.47)mm)]進行試驗。

1.2方法

1.2.1材料處理。將鰻弧菌(Vibrioanguillarum)菌種在2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，后用無菌海水離心洗脫3次，重懸菌液，將濃度調(diào)為OD600=0.4。隨機分組，每次試驗設置10個平行組。將鰻弧菌菌液注入至試驗組青蛤體內(nèi)，50 μl/只，對照組注射等量的滅菌海水。在注射前提取血淋巴、肝臟、外套膜、鰓、閉殼肌和性腺，分別在注射后3、6、12、24、48、96 h提取血淋巴。準確稱取各組織50 mg，后放入液氮中冷凍備用。

1.2.2青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建。利用TRIZOL提取青蛤各個組織的總RNA，用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits試劑盒分離mRNA。采用第二代MiSeq測序儀，pair end 雙端模式完成青蛤轉(zhuǎn)錄組測序，利用De novo RNA-seq analysis技術(shù)，綜合分析相關(guān)基因功能注釋和代謝途徑，后通過篩選得到CsIRAK-4基因的類似序列。

1.2.3生物信息學分析。利用獲得的CsIRAK-4基因類似序列設計克隆引物CsIRAK-4-S：5′-AGATGGAGGCAGGGTGAT-3′，CsIRAK-4-A：5′-TGGCAGAGGTGGCGTATT-3′，并進行克隆，與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫進行BLASTX比對，利用開放閱讀框(open reading frame，ORF)在線分析軟件分析其開放閱讀框，使用Sig-nalP 3.0分析該基因的信號肽序列，利用SMART查找其結(jié)構(gòu)域，ProtParam工具在線預測此序列的分子量、分子式和等電點，使用Clustal W對氨基酸序列進行同源性分析和多重比對。

1.2.4IRAK-4基因在青蛤各組織內(nèi)的表達。利用TRIZOL法提取青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ驭?actin基因為內(nèi)參基因，實時定量引物分別為βactin-S：5′-CACCACAACTGCCGAGAG-3′，βactin-A：5′-C-CGATAGTGATGACCTGACC-3′；CsIRAK-4-S：5′-AGATGGAGGCAGGGTGAT-3′，CsIRAK-4-A：5′-TGGCAGAGGTGGCGTATT-3′；反應在 Rotor-Gene 6000實時定量 PCR 儀上進行，擴增體系為 20 μl，反應程序：95 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5在鰻弧菌刺激下青蛤IRAK-4基因在血淋巴內(nèi)的時序性表達。利用TRIZOL法提取鰻弧菌侵染后各時間點血淋巴的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA。熒光定量PCR引物、反應體系及程序等參照“1.2.4”。采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1青蛤IRAK-4基因的結(jié)構(gòu)CsIRAK-4基因開放閱讀框長1 926 bp，共編碼641個氨基酸(圖1)；其共有2個結(jié)構(gòu)域：DEATH結(jié)構(gòu)域(35～129)和S_Tkc結(jié)構(gòu)域(380～638)；其理論分子量為72 552.8，等電點為5.89，分子式為C3206H5069N879O1005S17，氨基酸組成中亮氨酸(Leu)最高，占9.2%。此基因在GenBank的注冊號為KR732936。

2.2青蛤IRAK-4基因的分子系統(tǒng)學分析將CsIRAK-4基因與NCBI上已有的其他物種的IRAK-4基因進行同源性比對，使用MEGA4.1軟件構(gòu)建CsIRAK-4基因的系統(tǒng)樹(圖2)，利用bootstrap1000個循環(huán)檢驗拓撲結(jié)構(gòu)的置信度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜色鮑(Haliotisdiversicolor)、紅鮑螺(Haliotisrufescens)、霸王蓮花青螺(Lottiagigantea)、夏威夷短尾魷魚(Euprymnascolopes)與CsIRAK-4基因在同一分支，此基因與紅鮑螺(Haliotisrufescens)IRAK-4基因的同源性最高，達57%。

2.3青蛤IRAK-4基因在不同組織間的表達以β-actin基因在各組織中的表達量為內(nèi)參對照，利用實時熒光定量PCR分析CsIRAK-4基因在其血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、性腺和鰓6個組織中的表達情況。結(jié)果表明，CsIRAK-4基因在此6個組織中普遍表達(圖3)，但表達量明顯不同，在血淋巴中表達量最高，與其他組織相比差異極顯著(P<0.01)，閉殼肌次之，肝臟中表達量最低。表明CsIRAK-4基因主要在血淋巴中表達。

2.4在鰻弧菌刺激下青蛤IRAK-4基因在血淋巴中的時序性表達以鰻弧菌侵染青蛤β-actin基因為內(nèi)參基因，使用實時熒光定量PCR儀對CsIRAK-4基因在血淋巴中表達的時序性變化進行分析(圖4)。結(jié)果顯示，試驗組在刺激后3 h的表達量達到最大值，明顯高于對照組，約為對照組的17倍，并與對照組存在極顯著差異(P<0.01)；3 h后表達量開始下降。

3討論

該研究通過構(gòu)建青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的方法獲得了CsIRAK-4基因的類似序列，利用此序列設計引物并克隆，后進行測序，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因在進化中比較保守，與許多水生動物的IRAK-4基因具有明顯的相似性。通過SMART分析其蛋白序列，發(fā)現(xiàn)CsIRAK-4基因共有2個結(jié)構(gòu)域，分別為死亡結(jié)構(gòu)域(Death Domain)和激酶結(jié)構(gòu)域(S_TKc Domain)，死亡結(jié)構(gòu)域位于第35～129個氨基酸之間，激酶結(jié)構(gòu)域位于第380～638個氨基酸之間。死亡結(jié)構(gòu)域作為一種中介將死亡受體和胞漿信號相連通，在控制機體的凋亡過程中有重要作用。在IRAK基因家族中，只有IRAK-1基因、IRAK-4基因具有包含激酶結(jié)構(gòu)域的功能催化位點[21]，但只有IRAK-4基因在下游信號轉(zhuǎn)導通路中使用其激酶活性。同時，IRAK-4基因還具有一個高度保守的賴氨酸殘基，此殘基位于ATP結(jié)合位點，在ATP的水解過程中起關(guān)鍵作用[17，22]。IRAKs在TLRs的信號轉(zhuǎn)導過程中起著重要的媒介作用[20，23]，因此在先天免疫過程中IRAKs極為關(guān)鍵。

該研究結(jié)果顯示，CsIRAK-4基因在各個組織普遍表達，在血淋巴中表達量最高，閉殼肌次之，后依次為鰓、外套膜、性腺，在肝臟中表達量最低。貝類所具有的非特異性免疫體系中，血液的吞噬作用往往是抗病害的第一道防線，青蛤血液中含有大量的吞噬細胞、抗菌性物質(zhì)及酶原物質(zhì)，在病原物侵染過程中其免疫作用非常關(guān)鍵。血細胞中的CsIRAK-4基因上調(diào)最為明顯，說明血淋巴作為軟體動物的非特異性免疫防御的首要組織擔當著機體非特異性免疫防御的重任。而鰓和外套膜在軟體動物生存過程中最先接觸外界環(huán)境，是軟體動物抵御外界傷害的第一道防線，因此在其非特異性免疫過程中也極其重要。

CsIRAK-4所表達的產(chǎn)物是TLRs信號通路中重要的信號蛋白之一，當青蛤受到鰻弧菌脅迫后，其血淋巴中該基因在3 h即表達至最大值，說明病原物對TLRs免疫受體及下游 CsIRAK-4信號通路蛋白具有強烈的識別與誘導作用，可使其血液中快速合成相應的免疫信號蛋白，對抗外來脅迫物對機體自身的侵害。并且CsIRAK-4基因的表達量呈先升高后降低的趨勢，證明CsIRAK-4基因參與了非特異免疫的全部過程。該試驗結(jié)果為今后貝類增養(yǎng)殖中的病害防治提供了重要的試驗數(shù)據(jù)。

注：方框為起始密碼子，*表示終止密碼子，單下劃線部分為DEATH結(jié)構(gòu)域，雙下劃線表示 S_Tkc 結(jié)構(gòu)域。 圖1　青蛤IRAK-4 基因 cDNA 序列的開放閱讀框及功能域分析

圖2　CsIRAK-4基因和其他物種的IRAK-4基因氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹

圖3　CsIRAK-4基因在青蛤不同組織中的表達分布

注：##代表該時間點試驗組基因的表達量與注射前(0 h)相比差異極顯著(P<0.01)，**代表相同時間點試驗組與對照組基因的表達量差異極顯著(P<0.01)。 圖4　鰻弧菌刺激下青蛤血淋巴中IRAK-4基因的時序性表達

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注：建立系統(tǒng)樹所用的物種以及序列號為：Haliotisdiversicolor(ADC53123)；Haliotisrufescens(AGZ03661)；Lottiagigantea(XP_009050390)；Euprymnascolopes(AAY27972)；Crassostreagigas(XP_011428693)；Mytilusgalloprovincialis(AHI17286)；Aplysiacalifornica(XP_005104938)；Rattusnorvegicus(NP_001100261)；Daniorerio(AAT37635)；Homosapiens(NP_055258)。