李新明，高忠東，李 群，田志芳，郭志利(山西省農(nóng)業(yè)科學院加工所，山西太原030031)

糖尿病的主要特點表現(xiàn)為胰島素絕對或相對不足引起的血糖水平升高，同時常伴有脂肪代謝紊亂進而出現(xiàn)高脂血癥［1-2］。目前，已知核轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增生物激活受體(Peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)是一種激素激活受體和轉(zhuǎn)錄因子。迄今，3種PPAR亞型相繼被克隆，并且分別被命名為PPARα、PPARγ和PPARδ。PPAR是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪生成、胰島素敏感性、炎癥反應、細胞生長和分化的重要因子［3］，并可能在糖尿病性腎病、高血壓病和動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色［4-5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分天然產(chǎn)物活性成分有作為PPARγ激動劑、改善胰島素抵抗的潛能。

蘋果多酚是蘋果中所含多元酚類物質(zhì)的總稱，包含綠原酸、兒茶素、表兒茶素、根皮苷、根皮素、槲皮素、原花青素等活性物質(zhì)［6］。大量的試驗表明，蘋果多酚具有廣泛的生物藥理活性，包括抗腫瘤、抗氧化、降脂、抗動脈硬化、抗紫外線、預防糖尿病等功效［7-9］，已被廣泛用于保健食品、醫(yī)藥和化妝品中。筆者檢測了蘋果多酚對小劑量鏈脲佐菌素加高脂高糖飼料誘導的糖尿病模型小鼠血清丙二醛、血脂、血糖、胰島素水平以及肝、腎、脂肪組織PPARγ基因表達的影響，以便探討蘋果多酚在糖尿病防治方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 蘋果多酚由山西省農(nóng)業(yè)科學院加工所食品營養(yǎng)功能分析試驗室提取、制備;鏈脈佐菌素臨用前用檸檬酸緩沖液配制。

1.2 蘋果多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗 α-葡萄糖苷酶水解底物PNPG能生成對硝基苯酚(PNP)，在405 nm處能檢測到PNP的吸收峰。將1 ml不同濃度的蘋果多酚溶液加入到2 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8)中，再加入0.1 ml 1 U/ml α-葡萄糖苷酶混勻，在37℃下水浴10 min。接著，加入0.25 ml 10 mmol/L PNPG來起始反應，反應進行20 min后，加入2 ml 0.1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應，在400 nm處測定吸光度(A1)，用緩沖液代替蘋果多酚測定其吸光度值(A0)，用緩沖液代替酶液測定其吸光值(A2)［10］。試驗3次重復。

抑制率(%)=［1-(A1-A2)/A0］×100%

1.3 蘋果多酚對α-淀粉酶活性抑制試驗 100 μl不同濃度蘋果多酚溶液與100 μl淀粉酶溶液(5 mg/L)在室溫下預混合10 min后，加入可溶性淀粉溶液(200 μl 0.5%)來起動反應，反應中使用磷酸鹽緩沖液緩沖液(1 ml 25 mmol/L，pH 6.8)。反應混合液于37℃反應5 min后，加入1 ml DNS試劑中止反應，反應液置沸水浴中5 min后于冰水浴中迅速冷卻，加3 ml蒸餾水稀釋后測定540 nm吸收值，同時設(shè)樣品對照［11］。重復3 次試驗。

1.4 高糖高脂飼料的配制 配方為10%豬油、20%蔗糖、1%膽酸鹽、2.5%膽固醇、66.5%常規(guī)飼料。

1.5 小鼠糖尿病模型的建立 將雄性昆明種小鼠60只飼養(yǎng)7 d，檢測空腹血糖作為該批次動物的基礎(chǔ)血糖值。動物隨機分組，以12只作為正常對照組，普通飲食飼喂;另48只小鼠給予高脂高糖飲食28 d后，禁食不禁水16 h，腹腔注射STZ(50 mg/kg b.w.)。14 d 后，檢測小鼠空腹血糖、血脂、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)。選擇血糖值在10.0～25.0 mmol/L，同時伴脂代謝紊亂的模型小鼠用于正式試驗。將48只小鼠隨機分為模型組以及蘋果多酚高、中、低(10、7、4 mg/kg b.w.)劑量組，每組12只。連續(xù)灌胃60 d。60 d后，禁食12 h，眼球采血，分離血清。取肝臟、腎臟、脂肪組織，制成組織勻漿，備用。

1.6 生化指標測定 使用試劑盒，測定血清中MDA、SOD水平。所有的操作均按試劑盒說明進行。小鼠空腹血糖、血脂、胰島素、TG、TC、LDL-c、HDL-c用全自動生化儀測定。采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG);采用酶聯(lián)免疫測定法測定空腹血清胰島素(FINS)，計算胰島素抵抗指數(shù)。

HOMA-IR=(FBG × FINS)/22.50

1.7 實時定量PCR檢測PPARγ基因的表達 引物設(shè)計:PPARγ 上游 5＇-5＇-CATGGCCATTGAGTGCCGAGT-3＇，下游 5＇-ACATCCCCACAGCAAGGCAC-3＇;GAPDH 上 游 5＇-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3＇，下游5＇-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3＇。使用Trizol試劑從組織中提取總RNA，通過寡脫氧核苷酸和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，采用Tag DNA多聚酶PCR反應擴增cDNA產(chǎn)物，應用ABIPRISM 7000序列檢測系統(tǒng)測定mRNA拷貝和循環(huán)數(shù)的線型關(guān)系，設(shè)定標準曲線。將正常對照組mRNA的表達量設(shè)為1，計算各組mRNA的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 使用SPSS12.0軟件處理分析數(shù)據(jù)，試驗結(jié)果用±SD)表示，組間數(shù)據(jù)差異進行比較，當P＜0.05時表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

由圖1可知，蘋果多酚能顯著抑制α-葡萄糖苷酶活力。當蘋果多酚濃度從0增加到1.5 mg/L時，酶活力抑制率從16.4%增加到85.2%，之后隨著蘋果多酚濃度的繼續(xù)增加，酶活力抑制率不再顯著地增加。蘋果多酚對α-葡萄糖苷酶活力的 IC50約為0.9 mg/L。

由圖2可知，蘋果多酚能顯著抑制α-淀粉酶活力。當蘋果多酚濃度從0增加到1 g/L時，酶活力抑制率從0增加到52.3%，隨著蘋果多酚濃度的繼續(xù)增加，酶活力抑制率緩慢地增加。蘋果多酚對α-淀粉酶酶活力的IC50約為1 g/L。

由表1可知，與對照組相比，模型組小鼠血清MDA水平明顯增加，經(jīng)蘋果多酚干預處理后，血清MDA水平明顯降低;與對照組相比，模型組小鼠血清 SOD水平明顯降低，經(jīng)蘋果多酚干預處理后，血清SOD水平隨蘋果多酚的劑量增加而明顯增加。

表1 糖尿病小鼠血清MDA和SOD活力

由表2可知，模型組小鼠血清TG、TC和LDL-c水平均明顯增加，HDL-c降低;經(jīng)蘋果多酚干預處理后，血清TG、TC和LDL-C水平均明顯下降，而HDL-c明顯增加。這一降脂效果隨蘋果多酚的劑量增加而增加，呈明顯的量效關(guān)系。

表2 蘋果多酚對糖尿病小鼠血清TC、TG、LDL-c和HDL-c水平的影響 mmol/L

由表3可知，與正常對照組相比，模型對照組FBG、FINS、IRI均顯著升高;與模型對照組相比，蘋果多酚干預組FBG、FINS、IRI水平隨劑量的增加而降低。

由表4可知，各組小鼠的肝、腎、脂肪組織均有PPARγ mRNA的表達。與對照組相比，模型組小鼠肝、腎、脂肪組織PPARγ mRNA的表達均顯著減少;蘋果多酚干預后，各藥物處理組小鼠肝、腎、脂肪組織中PPARγ mRNA表達較模型組顯著增加。

表3 蘋果多酚對糖尿病小鼠血清FBG、FINS、IRI水平的影響

3 結(jié)論與討論

研究表明，高糖高脂飲食誘發(fā)出高胰島素血癥和胰島素抵抗，再通過注射亞致病劑量STZ破壞胰腺功能，導致胰腺代償性分泌胰島素的功能障礙，最后誘發(fā)出高血糖癥。這一模型制備過程模擬了臨床大部分2型糖尿病的發(fā)病過程［12］。因此，研究中通過高糖高脂飲食結(jié)合亞致病劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法制備2型糖尿病模型。

表4 蘋果多酚對糖尿病小鼠肝、腎、脂肪組織中PPARγ mRNA表達水平的影響

過去的研究證明，糖尿病與自由基損害密切相關(guān)［13］。作為機體的正常代謝產(chǎn)物，在平衡狀態(tài)下自由基在抗菌、消炎和抑制腫瘤等方面具有重要作用和意義。一旦平衡被打破，自由基便會產(chǎn)生強大的傷害作用，造成生物膜的脂質(zhì)過氧化損傷，引起酶、氨基酸、蛋白質(zhì)的氧化破壞，對內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)的形態(tài)功能產(chǎn)生影響，引起機體疾?。?4］。蘋果多酚具有很強的抗氧化、清除自由基的功效［15］。目前的研究結(jié)果表明，高糖高脂飲食結(jié)合STZ腹腔注射，試驗小鼠血糖值維持在10.0～25.0 mmol/L之間，同時伴有脂代謝紊亂，表明小鼠糖尿病模型的成功建立。通過測定各組小鼠血清MDA、SOD、TG、TC、LDL-C、HDL-C 水平，評估了蘋果多酚改善糖尿病的血脂代謝作用。結(jié)果顯示，蘋果多酚可抑制糖尿病小鼠血清中MDA、TC、TG、LDL-C水平的升高，還可明顯提高血清中HDL-C、SOD水平，表明蘋果多酚能較好地降低氧化應激，改善血脂代謝。

該研究通過血中丙二醛、血脂、血糖、血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)等指標綜合評價胰島素抵抗程度，進而對動物模型和藥物治療效果進行評價。研究表明，小鼠經(jīng)高糖高脂飼料喂養(yǎng)出現(xiàn)了血脂、血清葡萄糖、胰島素水平增加、胰島素抵抗指數(shù)上升等現(xiàn)象，表明小鼠出現(xiàn)嚴重胰島素抵抗，導致胰島β細胞代償性分泌更多胰島素以維持血糖穩(wěn)定，最終導致糖耐量受損。經(jīng)過3個月的蘋果多酚灌喂，小鼠血清葡萄糖、胰島素水平升高，血脂水平、血丙二醛水平和胰島素抵抗指數(shù)均顯著下降。這表明蘋果多酚能夠減輕胰島素抵抗，改善糖耐量。蘋果多酚具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗的功效，可能是通過降低血脂、抗炎、抗氧化，減少組織和血中自由基的形成，從而減少組織的氧化損傷。

PPARs是核激素受體配體激活的轉(zhuǎn)錄因子的超家族。其中，PPARγ主要富含于脂肪組織，并且對維持人類胰島素敏感性，葡萄糖穩(wěn)態(tài)是不可缺少的。當PPARγ基因突變或受其他因素抑制時，可致胰島素抵抗。此外，PPARγ的配體不僅能增強胰島素介導的葡萄糖攝取和減輕炎癥反應，而且能逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗的主要缺陷，抑制動脈粥硬化的發(fā)生，改善內(nèi)皮功能［16-18］。

研究還表明，與正常對照組相比，各組小鼠肝、腎、脂肪組織中PPARγ mRNA表達量均明顯降低。與模型對照組相比，蘋果多酚處理各組小鼠肝、腎、脂肪組織中PPARγ mRNA表達量均明顯增加，表明蘋果多酚能刺激糖尿病小鼠的PPARγ mRNA，使其表達量增加。

總之，蘋果多酚能夠增強糖尿病小鼠抗氧化功能，清除蓄積的自由基，降低血糖血脂，減輕胰島素抵抗，改善糖耐量。同時，蘋果多酚能夠顯著增強糖尿病小鼠肝、腎、脂肪組織PPARγ mRNA的表達水平。這可能是蘋果多酚改善糖、脂代謝紊亂以及防治糖尿病的作用機制之一。

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