班海俠， 鐘 敏， 雷曉凌， 陳 芳， 蔡加怡

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088)

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具抗菌及乙酰膽堿酯酶抑制活性珊瑚真菌的篩選

班海俠， 鐘 敏， 雷曉凌*， 陳 芳， 蔡加怡

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088)

為開發(fā)利用珊瑚真菌資源，以徐聞珊瑚保護區(qū)珊瑚樣品中分離鑒定的43株海洋真菌為研究對象，采用雙層平板法和Ellman法分別對其進行抗菌和乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制活性篩選。結(jié)果顯示，43株菌株至少對一種指示菌有抑制作用，且有12株菌株對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均表現(xiàn)出不同程度的抗菌活性，抗菌譜較廣；當濃度為1 mg/mL時，有8株菌株的發(fā)酵液提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制率達到50%以上。其活性菌株中曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢屬。

珊瑚真菌；抗菌活性；乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制活性；篩選

海洋微生物因獨特的環(huán)境(高鹽、高壓、寡氧、低溫等)使其產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、活性特異的次級代謝產(chǎn)物。據(jù)不完全統(tǒng)計，2010年1月至2013年2月已報道895個海洋微生物新化合物，其中576個來源于海洋真菌，占64.36%，這說明海洋真菌是產(chǎn)生新化合物的巨大寶庫[1-2]。作為海洋天然產(chǎn)物來源之一的珊瑚，資源豐富且種類較多，其粘液層、骨架和組織中都容納著豐富的微生物[3-4]，具有極大的開發(fā)潛力。目前已報道的珊瑚共附生真菌的生物活性主要包括抗菌、抗氧化、酶抑制、抗腫瘤以及抗病等多種生物活性作用。徐佳[5]對叢生盔型珊瑚分離出的19株共附生真菌進行酶抑制活性研究，研究結(jié)果表明，有4株共附生真菌同時對乙酰膽堿脂酶和葡萄糖苷酶具有抑制活性。肖勝藍[6]從普哥濱珊瑚、扁縮濱珊瑚、牡丹珊瑚3個珊瑚樣品中共分離到54株真菌，對其進行抗菌實驗的研究，共篩選到13株珊瑚真菌具有抗菌活性。本文對徐聞珊瑚保護區(qū)珊瑚樣品中分離到的43株海洋真菌進行研究，從中篩選出具抗菌及乙酰膽堿酯酶抑制活性的產(chǎn)生菌，為今后開發(fā)珊瑚真菌的應(yīng)用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 43株珊瑚共附生真菌均為本課題組分離鑒定并保存，分別分離自普哥濱珊瑚(Poritespukoensis)、扁縮濱珊瑚(Poritescompressa)、牡丹珊瑚(Pavonalamarck)、叢生盔形珊瑚(Galaxeafascicularis)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基;②PDB培養(yǎng)基：200 g新鮮馬鈴薯，去皮切片，煮沸30 min，紗布過濾去渣，加入20 g蔗糖，定容至1 000 mL，pH自然，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均采用70%的海水進行配置。

1.1.3 抗菌活性檢測指示菌 金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)，本實驗室保存菌種；SL1(登錄號：FJ404757.1，Pesudomonassp.)、SL2(登錄號：EF032-685.1,Kurthiagibsonii)、SL4(登錄號：HM625714.1,Chryseobacteriumsp.)，本課題組從冷凍對蝦中分離及鑒定的優(yōu)勢腐敗菌。

1.1.4 試劑 乙酸乙酯、甲醇、氯仿、石油醚、正丁醇，均為分析純，廣州華大化學(xué)試劑有限公司；碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙酰膽堿酯酶(AChE)、5,5′-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、碘化硫代乙酰膽堿(ATCh)、石杉堿甲，北京索萊寶生物科技有限公司等。

1.1.5 儀器設(shè)備 N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；DC-R 氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；Multiskan MK3 酶標儀(上海雷波分析儀器有限公司)；PHS-2C 精密酸度計(上海大普儀器有限公司)；722型分光光度計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 珊瑚共附生真菌粗提物的制備 將供試菌在PDA斜面培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)3～4 d，挑取2～3環(huán)分別接種到含100 mL PDB的250 mL三角燒瓶中，于28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)9 d。培養(yǎng)液經(jīng)抽濾得到菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液分別用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機相經(jīng)減壓濃縮至干，稱質(zhì)量，適量甲醇溶解后得到100 mg/mL的待測樣品?？挂阴Ｄ憠A酯酶活性測試前再用甲醇適當稀釋為不同濃度的溶液，備用。

1.2.2 指示菌菌懸液的制備 供試菌在LB斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次后，將其接種到LB液體培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)12～18 h，再用LB液體培養(yǎng)基將指示菌稀釋至細菌數(shù)為106cfu/mL。

1.2.3 抗菌活性菌株的篩選 采用雙層平板法[7-8]，首先制備瓊脂無菌平板，在平板上放置無菌牛津杯，然后采用稀釋倒平板法制備含菌平板，按照需要分別將上清發(fā)酵液100 μL加入到牛津杯中。每組實驗重復(fù)3次，并設(shè)陰性對照(不加粗提物)。細菌指示菌平板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)。48 h后觀察結(jié)果，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.4 乙酰膽堿酯酶抑制活性菌株的篩選 通過改進Ellman法[9]進行乙酰膽堿酯酶活性的測定。在96孔板中先加入140 μL 0.1 mol/L、pH 8的磷酸鹽緩沖液(PBS)，再加入20 μL待測樣品溶液和15 μL 1.25 U/mL的乙酰膽堿酯酶溶液，震蕩均勻后置于4 ℃培養(yǎng)20 min。再分別加入10 μL DTNB和10 μL ATCh，37 ℃反應(yīng)20 min，于酶標儀405 nm下讀取吸光度值(A)。用15 μL 0.1 mol/L、pH 8的PBS代替酶溶液, 為樣品本底對照孔；20 μL 125 μg/mL的石杉堿甲溶液代替20 μL待測樣品，為完全抑制對照孔；空白對照用20 μL 0.1 mol/L、pH 8的PBS代替待測樣品。

抑制率計算公式：

抑制率(%)=

2 結(jié)果與分析

2.1 珊瑚真菌抗菌活性菌株的篩選

各菌株發(fā)酵液萃取物的抗菌活性篩選結(jié)果如表1所示。這43株菌株均對一種或多種指示菌表現(xiàn)出抑制作用，其中對SL1(Pesudomonassp.)有抗菌活性的菌株最多，共有38株，占抗菌活性菌株數(shù)的88.38%，并且分布的菌株種群多，涉及14個屬；其次是拮抗SL2(Kurthiagibsonii)、SL4(Chryseobacteriumsp.)菌株，分別有37株和32株；對大腸埃希菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)有抗菌活性的菌株較少，分別為15株和14株；有19株菌株對5種指示菌有拮抗作用。在具有抗菌活性的菌株中，具有中等活性(15 mm≤抑菌圈直徑<25 mm)或高活性(抑菌圈直徑≥ 25 mm)的菌株有31株，占有活性菌株的72.10%。

根據(jù)菌株來源，在抗菌活性菌株中，普哥濱珊瑚、扁縮濱珊瑚、牡丹珊瑚、叢生盔形珊瑚各有19株、13株、4株和7株。曲霉(Aspergillus)是4種珊瑚共有的屬，共有14株為優(yōu)勢屬，占活性菌株的32.56%；普哥濱珊瑚和扁縮濱珊瑚的活性菌株種群分布最豐富，各有8屬，其中旋孢腔菌屬、硬孔菌屬、蕉孢殼屬、彎孢屬只在扁縮濱珊瑚中有分布；白念菌屬、香菇菌屬、擔子菌屬僅在扁縮濱珊瑚中有分布；叢生盔形珊瑚中有4個屬，座囊霉菌屬、透孢黑團殼、葡萄穗霉屬只出現(xiàn)在叢生盔形珊瑚。

續(xù)表1

注：菌株編號為Cxy-z，C代表珊瑚樣品，x為采樣的批次，y為同批次采樣珊瑚樣品號，1～4分別代表珊瑚樣品為普哥濱珊瑚、扁縮濱珊瑚、牡丹珊瑚、叢生盔形珊瑚,z為分離菌株的編號，表2同

2.2 珊瑚真菌乙酰膽堿酯酶抑制活性的篩選

采用改進的Ellman法對43株珊瑚真菌發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物進行抗乙酰膽堿酯酶活性篩選，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在一定濃度下，各菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對乙酰膽堿酯酶抑制活性存在較大的差異，且其抑制率隨萃取物濃度的降低呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢；當測定濃度為1 mg/mL時，有23株菌株表現(xiàn)出酶抑制活性，占菌株總數(shù)的53.49%，其中8株有較強的活性(抑制率>50%)，分別為C21-5、C21-11、C22-4、C21-2、C21-9、C22-5、C22-3、C14-22，抑制率依次為71.34%、66.13%、59.89%、58.92%、58.25%、57.25%、56.15%、51.34%，其余菌株活性較弱；這8株菌中，曲霉屬有4株，占其菌株總數(shù)的50%，枝頂孢屬、旋孢腔菌屬、硬孔菌屬、座囊霉菌屬各1株。

表2 43株珊瑚真菌乙酰膽堿酯酶抑制活性

續(xù)表2

注：“—”表示在所測定濃度下對乙酰膽堿酯酶無抑制活性

3 討 論

目前，發(fā)現(xiàn)的活性真菌主要分布在擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、色疣節(jié)梗孢屬(Gonatobotryum)等8個屬中[6]。本研究從珊瑚中篩選到的43株海洋真菌均對至少一種指示菌有抑制作用，曲霉(Aspergillus)是4種珊瑚共有的屬，共有14株為優(yōu)勢屬，占活性菌株的32.56%；同時抗菌活性菌株中有19株具有廣譜抗菌作用，能對5株指示菌有不同程度的拮抗作用，其中曲霉屬有7株，占36.85%，比例最高。

20世紀90年代后期，日本研究人員首次嘗試從微生物及代謝產(chǎn)物中篩選AChEI并獲得成功[10]，但國內(nèi)外從海洋微生物中篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究報道較少。本研究從43株珊瑚海洋真菌中篩選到23株菌株對乙酰膽堿酯酶有抑制作用，其中8株菌株活性較好，當質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，發(fā)酵液提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制率達50%以上，表明珊瑚海洋真菌對乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究具有潛力。此外，測定分析的菌株均對細菌有抑制活性，為進一步的研究奠定基礎(chǔ)。

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Screening of Coral Fungi with Antibacterial and AChE Inhibitory Activities

BAN Hai-xia, ZHONG Min, LEI Xiao-ling, CHEN Fang, CAI Jia-yi

(Coll.ofFoodSci. &Technol.,GuangdongOceanUni.,GuangdongProv.KeyLab.ofAquaticProductProcess. &Safety,KeyLab.ofAdvancedProcess.ofAquaticProductsofGuangdongInst.ofHigherLearning,Zhanjiang524088)

In order to develop coral fungi resources, the antibacterial and AChE inhibitory activities of 43 marine fungi isolated from Xuwen Coral National Nature Preserved Area were determined by agar diffusion assay and Ellman methods, respectively. The results showed that 43 strains of fungi had antibacterial activity against at least one indicator strain, among them twelve strains were found to have different degree of antibiotic activities against both Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria with fairly broad antibiogram; when the concentration was at 1 mg/mL, the extracts of fermentation broth from eight strains showed that the AChE inhibition rates were more than 50%.Aspergillusstrains were the dominant genus among these active strains.

coral fungus; antibacterial activity; AChE inhibitory activity; screening

廣東省科技計劃項目(2013B021100015)；湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目(2013C01023)

班海俠 女，碩士研究生。研究方向為海洋生物活性物質(zhì)研究。E-mail：syuanbhx@163.com

* 通訊作者。女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事海洋生物活性物質(zhì)、水產(chǎn)品安全控制等。E-mail：leixlteam@126.com

2015-01-29；

2015-03-20

Q936

A

1005-7021(2015)05-0023-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.005