李玉安，李佳，徐華梓，林大木，吳志鵬

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

豬小腸黏膜下層與嗅鞘細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)

李玉安1，李佳2，徐華梓1，林大木1，吳志鵬1

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

目的：探討以小腸黏膜下層（SIS）作為生物支架對嗅鞘細(xì)胞（OECs）增殖的生物相容性。方法：用Abraham法制取豬小腸黏膜下層，將小腸黏膜下層與純化的嗅鞘細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，單純嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)作為對照組；定期進(jìn)行倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料的黏附生長情況，及CCK8增殖實(shí)驗(yàn)定量檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組小腸黏膜下層與嗅鞘細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后，倒置顯微鏡下可見嗅鞘細(xì)胞在24 h內(nèi)即可貼壁生長；3～5 d后可見小腸黏膜下層邊緣嗅鞘細(xì)胞密集，黏附良好，形態(tài)以梭形細(xì)胞、三極細(xì)胞為主；不同時(shí)間點(diǎn)HE染色、電鏡下可見嗅鞘細(xì)胞與豬小腸黏膜下層附著緊密，細(xì)胞生長良好。CCK8細(xì)胞增殖定量檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞7～9 d后達(dá)平穩(wěn)水平，11 d后略下降；前5 d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），培養(yǎng)至第7天2組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論：未發(fā)現(xiàn)小腸黏膜下層對嗅鞘細(xì)胞增殖有抑制作用，兩者間生物相容性良好，有望用作生物支架供嗅鞘細(xì)胞黏附生長。

嗅鞘細(xì)胞；小腸黏膜下層；支架；脊髓損傷

組織工程利用嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植治療脊髓損傷成為近年來脊柱外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-5]，但由于缺乏理想的細(xì)胞移植支架材料，在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中單純移植OECs卻未得到預(yù)期的效果；因此選擇合適的支架材料用以O(shè)ECs移植以增強(qiáng)脊髓損傷修復(fù)效果是今后研究方向之一。小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）作為支架材料在修復(fù)組織缺損的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中取得滿意效果[6-8]，有一定臨床應(yīng)用前景[9]。本實(shí)驗(yàn)將體外分離培養(yǎng)的OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)并探討以小腸黏膜下層作為OECs移植支架材料的可能性。

1 材料和方法

1.1 SIS生物支架材料制備 參照Abraham法[10]取成年豬的新鮮近段空腸，沖洗后刮除黏膜層、漿膜層和肌層；進(jìn)一步應(yīng)用化學(xué)方法：①在含有乙二胺四乙酸（100 mmol/L）和氫氧化鈉（10 mmol/L）溶液（pH值11～12）中浸泡16 h；②用去離子水沖洗干凈，置于含鹽酸（1 mmol/L）和氯化鈉（1 mmol/ L）溶液（pH值0～1）中浸泡6～8 h；③用去離子水沖洗后在1 mmol/L氯化鈉磷酸緩沖液（PBS）中浸泡16 h；④用去離子水沖洗后在PBS溶液（pH值7～7.4）中浸泡2 h；⑤再用去離子水沖洗基質(zhì)2 h；⑥殺菌：將SIS在含0.1%過氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液清洗2 h，然后程序性降溫至-80 ℃，凍干后用γ射線照射（25～35 kGy）消毒，進(jìn)行脫細(xì)胞和滅菌處理。

1.2 OECs的體外培養(yǎng)及鑒定 選取8～10周齡的成年SD大鼠，無菌條件下切取嗅球、剪碎，用含0.02% EDTA-0.25%胰蛋白酶消化15～20 min，再用含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。機(jī)械輕柔吹打20～30次，于水平離心機(jī)中以300 g離心5 min，去除上清液留沉淀物，加入含10%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)液，重懸成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，然后采用18 h單次差速貼壁的方法純化培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞處理后OECs純度達(dá)70%～80%，10～12 d細(xì)胞長滿瓶底，消化后將細(xì)胞接種于玻片，使用神經(jīng)生長因子受體P75（NGFRP75）和碘化丙啶（PI）雙重免疫熒光鑒定嗅鞘細(xì)胞[11-12]。

1.3 分組方法 實(shí)驗(yàn)組為OECs與SIS的復(fù)合培養(yǎng)，將SIS剪成96孔板洞孔大小，平鋪于96孔板中，Hanks液浸泡24 h；取生長狀態(tài)良好的OECs細(xì)胞懸液100 μL，濃度為1×105/mL滴加于SIS表面，加培養(yǎng)液置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對照組為單純嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)，直接將OECs懸液加于無SIS材料孔中進(jìn)行培養(yǎng)，每組各有7對，每對各設(shè)6孔。

1.4 細(xì)胞觀察方法 ①每天于相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)基有無混濁、細(xì)胞生長及與SIS材料附著的情況；②分別于OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)1、3、5、7、9、11、13 d后取出SIS，用D-Hanks液洗滌干凈后進(jìn)行HE染色觀察；③OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)1、3、5、7、9、11、13 d后取出SIS，2%戊二醛固定2 h，再用1%鋨酸后固定2 h。乙醇梯度脫水，HITACHI E-1010型離子濺射儀中噴金，于HITACHI S-3000N掃描電鏡下觀察。

1.5 CCK8細(xì)胞增殖定量檢測 分別于OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)1、3、5、7、9、11、13 d后對2組進(jìn)行CCK8細(xì)胞增殖定量檢測。實(shí)驗(yàn)操作方法按照試劑盒（上海碧云天科技有限公司）的程序進(jìn)行，用酶標(biāo)儀于450 nm，參比波長600 nm下測定OD值。每個(gè)時(shí)間段各取6個(gè)孔樣本，檢測結(jié)果取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組18～24 h后可見大量雙極和三極細(xì)胞貼壁生長，也有少量多角扁平細(xì)胞生長；3～5 d后細(xì)胞突起進(jìn)一步延長并開始連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在SIS周邊區(qū)域細(xì)胞比較密集，黏附良好，多呈長梭形生長。7～9 d網(wǎng)孔更密集，出現(xiàn)部分區(qū)域1～2層細(xì)胞重疊生長。11～13 d細(xì)胞數(shù)量達(dá)至最大，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)鑒定其抗P75抗體呈陽性，見圖1。

2.2 HE染色觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組1 d后行HE染色尚很難在SIS材料上發(fā)現(xiàn)細(xì)胞。將OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)3～5 d后，幾乎可以在SIS的任意區(qū)域發(fā)現(xiàn)OECs細(xì)胞，呈單層生長，與SIS黏附緊密。7～13 d時(shí)細(xì)胞進(jìn)一步增多，部分區(qū)域細(xì)胞呈2～3層重疊生長，見圖2。

2.3 掃面電鏡觀察結(jié)果 OECs細(xì)胞在SIS表面生長旺盛，黏附良好，呈長梭、紡錘或長三角形，胞體立體感強(qiáng)，突起細(xì)長，連接成網(wǎng)或成束排列，部分細(xì)胞表面可見蛋白顆粒分泌。5～7 d后呈密集生長，突起聯(lián)系增多，網(wǎng)孔減小，連接成片，見圖3。

圖1 OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)3～5 d后OECs增殖明顯，細(xì)胞突起進(jìn)一步延長并開始連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（×200）

圖2 OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)7～13 d，OECs進(jìn)一步增殖，部分區(qū)域細(xì)胞呈2～3層重疊生長（×400）

圖3 OECs細(xì)胞與SIS復(fù)合培養(yǎng)7 d呈密集生長，突起聯(lián)系增多，網(wǎng)孔減小，連接成片，細(xì)胞表面可見蛋白分泌顆粒（×400）

2.4 CCK8細(xì)胞增殖定量檢測結(jié)果 OECs與SIS復(fù)合培養(yǎng)后增殖良好，細(xì)胞總量隨著時(shí)間延長逐漸增高，第7天后細(xì)胞數(shù)量即達(dá)較高水平，11 d時(shí)達(dá)頂峰，隨后開始下降。OD值第1天（1.38±0.10）逐漸增加至第11天（2.65±0.20）。OECs組增殖趨勢與復(fù)合培養(yǎng)基本一致。第1、第3、第5天對照組OD值比實(shí)驗(yàn)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；第7、第9、第11、第13天2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 CCK8細(xì)胞增殖定量檢測結(jié)果（OD值，n=6，）

表1 CCK8細(xì)胞增殖定量檢測結(jié)果（OD值，n=6，）

天數(shù)實(shí)驗(yàn)組對照組tP 11.38±0.101.72±0.047.783＜0.001 31.87±0.092.51±0.265.740＜0.001 52.40±0.102.63±0.143.2910.008 72.49±0.322.60±0.120.7790.454 92.61±0.322.71±0.150.7380.478 112.65±0.202.68±0.240.1850.857 132.48±0.562.38±0.460.3270.750

3 討論

隨著對OECs研究的逐漸深入以及OECs移植治療脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的廣泛開展，近年來國內(nèi)外已經(jīng)陸續(xù)開展了利用OECs移植治療脊髓損傷的人體臨床試驗(yàn)，但是令人感到遺憾的是這些臨床試驗(yàn)在療效上未達(dá)到預(yù)期[14-16]。因此我們需要在OECs移植同時(shí)求助于其他的他輔助手段。研究[17-18]表明，脊髓損傷后局部常形成膠質(zhì)瘢痕與較大的空洞，單獨(dú)OECs移植后細(xì)胞在瘢痕空洞中缺乏細(xì)胞外基質(zhì)的支持作用，細(xì)胞在空洞中缺乏可以黏附生長的支架，細(xì)胞因子與細(xì)胞外基質(zhì)的分泌亦難以在局部聚集以形成有利于細(xì)胞生存的微環(huán)境。因此合適的支架材料也是修復(fù)脊髓損傷的關(guān)鍵。

SIS是一種不含細(xì)胞的天然細(xì)胞外基質(zhì)生物材料，主要由I型膠原和 III型膠原纖維組成，含有少量的V型和VI型膠原纖維，組成上接近于天然結(jié)締組織的成分，是一種理想的支架材料。很多的體外實(shí)驗(yàn)[7-8，19-21]都證實(shí)了SIS：①有良好的組織相容性；②可降解性和降解速率可控性；③無抗原作用；④維持細(xì)胞形態(tài)和表型，并增進(jìn)細(xì)胞的黏附和生殖，誘導(dǎo)組織再生；⑤有一定孔隙率；⑥有一定機(jī)械強(qiáng)度。另外SIS已經(jīng)在修復(fù)下尿路、膀胱、血管、肌腱、韌帶、骨、半月板等多種組織缺損的實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究中取得了良好的效果。

本實(shí)驗(yàn)在體外將SD大鼠嗅球OECs與豬SIS進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)OECs在SIS表面生長旺盛，增殖迅速，兩者之間黏附緊密。同正常培養(yǎng)的OECs相比，與SIS復(fù)合培養(yǎng)的OECs雖在早期生長稍弱，但在后期增殖迅速，數(shù)量上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過CCK8細(xì)胞增殖定量檢測發(fā)現(xiàn)OECs和SIS復(fù)合培養(yǎng)與正常培養(yǎng)的OECs相比在細(xì)胞增殖方面，1～5 d時(shí)兩者增殖程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中OECs與SIS復(fù)合組稍弱，但7 d后兩者的細(xì)胞增殖程度的差異就已經(jīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義了。7 d對于嗅鞘細(xì)胞來講尚處于對數(shù)生長期，而臨床上獲取細(xì)胞通常在這個(gè)階段或之后，因此在獲取細(xì)胞時(shí)兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此本實(shí)驗(yàn)雖未發(fā)現(xiàn)SIS對OECs有促增殖作用，但在SIS材料上復(fù)合培養(yǎng)的OECs在形態(tài)上與正常培養(yǎng)的OECs相同，生長旺盛，且在培養(yǎng)中后期（5～7 d后）與正常培養(yǎng)的OECs數(shù)量上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，較為客觀地說明了SIS與OECs具有良好相容性。SIS作為支架材料，在進(jìn)行細(xì)胞移植獲取細(xì)胞的時(shí)候，生長于SIS上的OECs可以同SIS一起取下，避免了酶的消化對細(xì)胞的損傷。更為重要的一點(diǎn)是，SIS作為OECs的生長支架，隨著OECs一起進(jìn)行移植進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，等同于給OECs營造了一個(gè)熟悉的生長環(huán)境，更有利于移植的OECs存活，使其發(fā)揮強(qiáng)大的修復(fù)脊髓損傷的功能。另外SIS對脊髓空洞的填充作用，避免了細(xì)胞的懸浮及流失，進(jìn)一步促進(jìn)了OECs功能的發(fā)揮。

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（本文編輯：吳彬）

Biocompatibility experiment of small intestinal submucosa with olfactory ensheathing cells

LI Yu’an1, LI Jia2, XU Huazi1, LIN Damu1, WU Zhipeng1. 1.Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the biocompatibility of small intestinal submucosa as a biological scaffold on the proliferation of olfactory ensheathing cells. Methods: The porcine small intestinal submucosa (SIS) was made according to Abraham’s methods. seeding the OECs on the porcine SIS for experimental group (SIS+OECs), OECs cultivating alone as control group. Then OECs’ growth, adhesion and proliferation of OECs on SIS was examined by HE stained and scanning electron microscope at different time during the cultivation, and the proliferation of OECs was examined with CCK8 as well. Results: OECs could attach to SIS within 24 hours after seeded on the SIS. After being cultured 3 to 5 days, OECs were intensive on the edge of SIS, well adhered to it and the cells were most fusiform and tripolar in shape. The combination of SIS and OECs was very excellently examinated by scanning electron microscope and Haematoxylin and eosin stained. And CCK8 measurement also revealed that, the quantity of OECs reached a stable level at 7 to 9 day and this level would not decreased until 11 d. Compared with these in contrast group, the proliferation of OECs on SIS had obvious difference during the former 5 days (P＜0.05) but there was no signifcant difference after 7 day (P＞0.05). Conclusion: Porcine SIS has good biocompatibility with rat OECs, although there is no evidence showing SIS promoting OECs’ proliferation. SIS can expectedly be used in repair of spinal cord injury as a scaffold where OECs may grow and adhere.

olfactory ensheathing cells; small submucosa intestinal; scaffold; spinal cord injury

R318.19

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.007

2014-07-31

溫州市科技局對外合作項(xiàng)目（H20080031）。

李玉安（1983-），男，浙江溫州人，碩士。

徐華梓，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，Email：spine xu@163.com。