在線固相萃?。合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜法同時(shí)定性定量檢測(cè)全血和尿液中7 種抗凝血?dú)⑹笏?/h1>
2015-12-26 01:57:46黃克建盧敏萍林翠梧劉曉鋒朱定姬喬文濤李宏森黃曉青
色譜 2015年7期
黃克建 ， 盧敏萍， 周 哲， 林翠梧， 楊 寧， 劉曉鋒， 朱定姬，梁 平， 喬文濤， 李宏森， 李 璐， 黃曉青
（1. 廣西壯族自治區(qū)公安廳物證鑒定中心，廣西 南寧530012；2. 廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧530004；3. 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，上海201206；4. 廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院，廣西 南寧530021）
抗凝血?dú)⑹笏幨悄壳皬V泛使用的一類(lèi)慢性殺鼠藥，由4-羥基香豆素或茚二酮母體結(jié)構(gòu)衍生而來(lái)［1］?？鼓?dú)⑹笏庍M(jìn)入機(jī)體后，會(huì)拮抗維生素K1的活性，抑制肝臟產(chǎn)生凝血酶原及凝血因子，使凝血酶失去活性，同時(shí)提高毛細(xì)血管通透性和脆性，因而造成各臟器及黏膜大面積出血而死亡［2］。與急性殺鼠藥如毒鼠強(qiáng)相比，該類(lèi)慢性殺鼠藥由于具有廣譜、高效、適口性好、毒性相對(duì)較低、不易引起二次中毒且有特效解毒藥維生素K1 等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于室內(nèi)和野外殺鼠工作［3］。由于這類(lèi)藥物比較容易獲得，近年來(lái)人、家畜、野生動(dòng)物等中毒情況時(shí)有發(fā)生。目前，檢測(cè)生物樣品中抗凝血?dú)⑹笏幰殉蔀楣矙C(jī)關(guān)刑事技術(shù)部門(mén)日常主要任務(wù)之一。因此，建立一種快速檢測(cè)血液和尿液中抗凝血?dú)⑹笏幍姆椒ǎ蔀橹卸菊邔?duì)癥治療、公安機(jī)關(guān)立案?jìng)善萍霸V訟提供科學(xué)依據(jù)。
目前，抗凝血?dú)⑹笏幍臋z測(cè)方法主要有薄層色譜法（TLC）、紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）［3，4］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［5］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS／MS）［6-16］。TLC 和UV-Vis 檢測(cè)靈敏度低，難以滿(mǎn)足檢測(cè)要求；GC 和GC-MS 前處理耗時(shí)長(zhǎng)，衍生化過(guò)程復(fù)雜，且抗凝血?dú)⑹笏幫ǔＯ鄬?duì)分子質(zhì)量較大，部分甚至含有羥基，不易氣化，不宜用GC 和GC-MS 分析；HPLC 可以準(zhǔn)確檢測(cè)μg／mL、μg／g 級(jí)的樣品，但以色譜保留時(shí)間作為唯一定性指標(biāo)缺乏足夠的選擇性，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果［1］。而LC-MS／MS 則結(jié)合了色譜分離與質(zhì)譜結(jié)構(gòu)確證的優(yōu)勢(shì)，樣品前處理無(wú)須衍生化，可選擇多級(jí)離子掃描檢測(cè)，能同時(shí)進(jìn)行多組分的定性確證和定量分析，具有靈敏度高、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于抗凝血?dú)⑹笏幍臋z測(cè)中。由于尿液、血樣、組織等生物樣品的基質(zhì)成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)等基質(zhì)成分嚴(yán)重影響定性和定量結(jié)果；且樣品中的鹽不但會(huì)干擾質(zhì)譜分析的離子化過(guò)程，還會(huì)污染離子源，使靈敏度大大降低［17］。因此，在應(yīng)用LC-MS／MS 進(jìn)行定性與定量分析時(shí)，一般需要進(jìn)行樣品前處理，這是極為重要的環(huán)節(jié)，也常是最耗時(shí)、最困難的工作［18］?，F(xiàn)有的抗凝血?dú)⑹笏帢悠非疤幚矸椒ㄍǔ２捎玫鞍踪|(zhì)沉淀法［3］、液液萃取法［4，5，8-13］和離線固相萃取法（offline SPE）［6，7，14-16］等。這些方法均可起到富集、減少基質(zhì)干擾的作用，但存在操作繁瑣、步驟多、耗材成本高、重現(xiàn)性差、低通量等問(wèn)題。與傳統(tǒng)的液液萃取、離線固相萃取相比，近年發(fā)展起來(lái)的在線固相萃?。╫n-line SPE）技術(shù)顯著簡(jiǎn)化了樣品前處理工作，因具有自動(dòng)化程度高、富集效果好、樣品損耗低、SPE 柱可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在藥物分析、食品安全、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［18-20］。目前，尚未見(jiàn)關(guān)于抗凝血?dú)⑹笏幍脑诰€固相萃取前處理方法的報(bào)道。
本研究建立了在線固相萃取／液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜（on-line SPE／LC-LIT／MS）快速檢測(cè)血液、尿液中克滅鼠、殺鼠靈、殺鼠醚、敵鼠、氯敵鼠、溴敵隆和大隆7 種抗凝血?dú)⑹笏幍姆治龇椒ǎ瑸橹卸景福ㄊ拢┘目鼓獨(dú)⑹笏幍目焖俸Y查提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
DionexTMUltimate 3000TM雙三元液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），配備DGP-3600SD 脫氣機(jī)、TCC-3000SD 柱溫箱（帶六通閥）、WPS-3000TFC-ANALYTICAL 自動(dòng)進(jìn)樣器、MWD-3000 紫外檢測(cè)器。質(zhì)譜系統(tǒng)：LTQ XLTM型線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），配加熱電噴霧離子源（HESI-II）、XcaliburTM數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Mass Frontier 7.0TM軟件。3-18R 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)TOMOS 公司）；SB 3200-HT 超聲波清洗器（必能信上海有限公司）；Master-s UV 超純水發(fā)生器（上海和泰儀器有限公司）。
克滅鼠（coumafuryl，純度99.0%）、殺鼠醚（coumatetralyl，純度99.9%）、殺鼠靈（warfarin，純度97.2%）、敵鼠（diphacinone，純度98.0%）、氯敵鼠（chlorophacinone，純度98.9%）、溴敵?。╞romoadiolone，純度93.6%）和大?。╞rodifacoum，純度99.3%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純（美國(guó)Fisher 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
分別準(zhǔn)確稱(chēng)取7 種標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解定容，配制成200 μg／mL 的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-15 ℃下保存。使用時(shí)根據(jù)需要用乙腈稀釋?zhuān)渲瞥刹煌|(zhì)量濃度的單標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.2 在線固相萃取和色譜條件
在線SPE 柱：Waters Oasis?HLB（20 mm×3.9 mm，15 μm）。左泵為在線固相萃取泵，流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：甲醇。分析柱：Dionex AcclaimTMRSLC 120 C18（100 mm×3.0 mm，2.2 μm）。右泵為分析泵，流動(dòng)相A：0.02 mol／L 乙酸銨溶液；流動(dòng)相B：甲醇。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量50 μL；梯度洗脫條件及六通閥切換程序見(jiàn)表1，on-line SPE／HPLCMS 流路圖見(jiàn)圖1。
表1 梯度洗脫條件及六通閥切換程序Table 1 Gradient elution and valve switching programs
圖1 在線固相萃?。合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜的流路圖Fig.1 Diagram of on-line SPE／HPLC-MS
1.3 質(zhì)譜條件
電離方式為ESI 負(fù)離子模式；噴霧電壓為4 000 V；棱鏡電壓為85 V；氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣，其中鞘氣35 arb；輔助氣15 arb；氦氣用作碰撞氣；離子源溫度為300 ℃；毛細(xì)管溫度為350 ℃；隔離窗口為2 amu；采用保留時(shí)間鎖定目標(biāo)化合物二級(jí)子離子全掃描方式，分別記錄7 種抗凝血?dú)⑹笏幍亩?jí)子離子數(shù)據(jù)。保留時(shí)間鎖定窗口見(jiàn)圖2，主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
1.4 樣品處理
吸取0.5 mL 全血和尿液，分別置于10 mL 試管中，再分別加入1 mL 乙腈，然后渦旋振蕩1 min，隨后分別加入3.5 mL 乙酸銨水溶液（0.02 mol／L），超聲提取5 min 后在10 000 r／min 的轉(zhuǎn)速下離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，供LC-MS分析。
表2 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍闹饕|(zhì)譜參數(shù)Table 2 Main MS parameters of the seven anticoagulant rodenticides
圖2 7 種抗凝血?dú)⑹笏幫瑫r(shí)分析時(shí)的采集時(shí)間窗口Fig.2 Data acquisition time window for simultaneous analysis of the seven anticoagulant rodenticides
2 結(jié)果與討論
2.1 在線SPE 條件的優(yōu)化
選用合適的在線SPE 柱和設(shè)計(jì)合理的富集凈化和洗脫條件，是在線SPE 方法的關(guān)鍵［19］。本方法選用Waters Oasis?HLB 柱作為在線SPE 柱，該柱為反相保留機(jī)理，對(duì)酸性、中性和堿性化合物均具有吸附作用，富集效果好，是一種通用型萃取柱?？疾炝碎y切換時(shí)間對(duì)萃取的影響，用SPE 柱代替分析柱直接與質(zhì)譜檢測(cè)器連接，以水為流動(dòng)相，結(jié)果樣品中基質(zhì)流出SPE 柱所需的時(shí)間為3 min，閥切換時(shí)間應(yīng)晚于該時(shí)間，因此選擇在4 min 時(shí)將閥由1_2切換至6_1 狀態(tài)，既有效除去基質(zhì)干擾，又保證了目標(biāo)分析物有較高的萃取效率。
另外考察了分析柱流動(dòng)相中有機(jī)相的初始比例對(duì)目標(biāo)物洗脫和分離的影響。有機(jī)相初始比例高，可以將目標(biāo)物快速轉(zhuǎn)移至分析柱，但目標(biāo)物在短時(shí)間內(nèi)集中流出，不利于分離。實(shí)驗(yàn)最終選擇40% 的有機(jī)相初始比例，既可以有效避免色譜峰展寬問(wèn)題，提高響應(yīng)值，又可以使7 種殺鼠藥得到較好的分離。
2.2 分析柱的選擇
抗凝血?dú)⑹笏幹饕ㄜ釢M(mǎn)二酮類(lèi)和4-羥基香豆素類(lèi)兩種，其中敵鼠、氯敵鼠屬于前者，含有多個(gè)羰基構(gòu)成的酰亞胺結(jié)構(gòu)；溴敵隆、溴鼠靈、克鼠靈、殺鼠醚和殺鼠靈屬于后者，含有α，β-不飽和羰基及羥基，因此這7 種殺鼠藥均為弱酸性化合物，并有一定的極性。
考察了Hypersil GOLD C8、Hypersil GOLD C18 和AcclaimTMRSLC 120 C18 型分析柱對(duì)7 種殺鼠藥的保留作用，通過(guò)分析比較峰形、分離效果和響應(yīng)值，最終選擇AcclaimTMRSLC 120 C18 作為分析柱，7 種殺鼠藥的提取離子色譜圖見(jiàn)圖3。
圖3 7 種殺鼠藥的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of the seven anticoagulant rodenticides
2.3 流動(dòng)相的選擇
樣品中分析物的保留行為是分析物與固定相、流動(dòng)相相互作用的結(jié)果，因此流動(dòng)相選擇適當(dāng)與否對(duì)分析物的分離尤其重要。對(duì)乙腈-乙酸銨水溶液和甲醇-乙酸銨水溶液兩種體系進(jìn)行了考察，在相同條件下，采用甲醇-乙酸銨水溶液為分析流動(dòng)相時(shí)，7種殺鼠藥的響應(yīng)值明顯更高。以甲醇-乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，考察了甲酸對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.05% ～0.1% 時(shí)，7種殺鼠藥的峰形較寬，且均出現(xiàn)了不同強(qiáng)度的［MH＋68］-峰，推測(cè)為目標(biāo)物與甲酸鈉（HCOONa）結(jié)合形成的，其中敵鼠和氯敵鼠最為明顯，不但拖尾嚴(yán)重，還出現(xiàn)了較強(qiáng)的［M-H＋68］-峰；而流動(dòng)相不含甲酸時(shí)，7 種殺鼠藥色譜峰形對(duì)稱(chēng)，［M-H＋68］-峰消失，且敵鼠和氯敵鼠的［M-H］-響應(yīng)值比含甲酸情況下提高了10 倍以上?？赡茉蚴? 種殺鼠藥均為弱酸性化合物，其在酸性流動(dòng)相中形成分子態(tài)，不利于色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)，當(dāng)流動(dòng)相不加甲酸時(shí)，pH 高于分析物的pKa2 個(gè)單位以上，有利于色譜分離和提高分析物的離子化效率，7 種殺鼠藥的pKa值見(jiàn)表3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇甲醇和0.02 mol／L 乙酸銨水溶液為流動(dòng)相。
表3 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍膒Ka 值Table 3 pKa values of the seven anticoagulant rodenticides
2.4 基質(zhì)溶液酸堿性對(duì)萃取效率的影響
比較了基質(zhì)溶液pH 值分別為4.8、7.0 和9.2時(shí)7 種抗凝血?dú)⑹笏幍妮腿⌒Ч?。結(jié)果表明，在不同pH 值下均能萃取到7 種抗凝血?dú)⑹笏?，總體來(lái)說(shuō)酸性和中性條件下萃取效果比較好，堿性條件下雖然也能獲得較好的萃取效果，但重現(xiàn)性較差。結(jié)合流動(dòng)相考慮，最終選取0.02 mol／L 乙酸銨水溶液（pH 7.0）為樣品的稀釋液?；|(zhì)酸堿性對(duì)萃取效率的影響見(jiàn)圖4。
2.5 乙腈加入量對(duì)萃取效率的影響
圖4 基質(zhì)溶液pH 對(duì)萃取效率的影響Fig.4 Influence of pH value of matrix solution on extraction efficiency
血液和尿液樣品用SPE 處理時(shí)，常需加入有機(jī)溶劑來(lái)沉淀蛋白質(zhì)，以降低堵塞SPE 柱的風(fēng)險(xiǎn)。選取乙腈為蛋白沉淀劑，考察了基質(zhì)溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果如圖5 所示，基質(zhì)溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為5% ～45% 時(shí)均能萃取到藥物，綜合考慮后選擇添加20% 乙腈。
圖5 乙腈含量對(duì)萃取效率的影響Fig.5 Influence of volume percentage of acetonitrile on extraction efficiency
2.6 定量離子的選擇
本研究采用從二級(jí)全掃描信號(hào)中提取子離子進(jìn)行定量的方式，故二級(jí)離子的選擇對(duì)定量結(jié)果有重要的影響。對(duì)碎裂機(jī)理進(jìn)行研究，選擇高靈敏度和高專(zhuān)屬性的碎片作為定量離子。香豆素類(lèi)抗凝血?dú)⑹笏幰粋€(gè)較為常見(jiàn)的碎片為香豆素基團(tuán)形成的m／z 161 碎片，該碎片是克滅鼠和殺鼠靈的優(yōu)勢(shì)碎片，故選擇m／z 161 為兩者的定量離子；殺鼠醚、大隆的優(yōu)勢(shì)碎片都是脫去O-C＝O 基團(tuán)、中性丟失44 后形成的碎片離子，故分別選擇m／z 247 和m／z 477 為兩者的定量離子；溴敵隆因存在獨(dú)立羥基，優(yōu)勢(shì)碎片是由脫O-C＝O 和脫H2O 共同形成的m／z 463，選擇其作為定量離子。茚二酮基團(tuán)形成的m／z 145 離子是茚二酮類(lèi)抗凝血?dú)⑹笏幮纬傻闹饕槠?，在敵鼠和氯敵鼠的二?jí)質(zhì)譜圖中均可觀察到響應(yīng)較高的m／z 145 峰，但這兩個(gè)化合物的優(yōu)勢(shì)碎片是乙?；鶖嗔押笥啥交鶊F(tuán)形成的離子，這可能與二苯基可以更好地共軛電子有關(guān)，故分別選擇m／z 167 和m／z 201 為兩者的定量離子。各藥物的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式見(jiàn)圖6。
圖6 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍亩?jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.6 MS2and fragmentation patterns of the seven anticoagulant rodenticides
2.7 自建數(shù)據(jù)庫(kù)定性確證
在Mass Frontier 7.0 的Database Manager 中建立7 種抗凝血?dú)⑹笏幍囊合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，庫(kù)中包括化合物名稱(chēng)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、CAS 登錄號(hào)、結(jié)構(gòu)式、二級(jí)質(zhì)譜圖和保留時(shí)間等信息。進(jìn)行定性檢索時(shí)采用聯(lián)合組分檢測(cè)（Joint Components Detection）算法，對(duì)樣品數(shù)據(jù)中的組分進(jìn)行查找?；谒须x子輪廓圖最大值的統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)提取各個(gè)質(zhì)譜峰豐度輪廓圖，可創(chuàng)建出樣品中化合物的純凈質(zhì)譜樹(shù)，生成相應(yīng)的峰形，并自動(dòng)與庫(kù)中化合物的母離子、碎片離子和保留時(shí)間等信息匹配。在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，也能夠通過(guò)本方法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速準(zhǔn)確定性篩查。該數(shù)據(jù)庫(kù)為開(kāi)放體系，可在后續(xù)工作過(guò)程中不斷增加目標(biāo)化合物至數(shù)據(jù)庫(kù)中，為應(yīng)用的進(jìn)一步拓展提供了前景。
2.8 方法的線性范圍和檢出限
在空白血液和尿液中添加7 種抗凝血?dú)⑹笏幍幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液，得到0.10 ～1 000 ng／mL 系列樣品，按1.4 節(jié)方法進(jìn)行處理。以目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度C（ng／mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，繪制7 種殺鼠藥的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。采用逐步稀釋法進(jìn)行測(cè)試，以信噪比（S／N）≥3 確定檢出限（LOD），以S／N≥10 確定定量限（LOQ）。7 種殺鼠藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限等結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍木€性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r2），limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the seven anticoagulant rodenticides
2.9 方法的加標(biāo)回收率及精密度
在空白血液和尿液中分別添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)溶液，按1.4 節(jié)方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度水平均平行測(cè)定6 次，考察方法的精密度和回收率（見(jiàn)表5）。
表5 全血和尿液中7 種抗凝血?dú)⑹笏幍募訕?biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 5 Recoveries and precisions of the seven anticoagulant rodenticides in whole blood and urine samples （n＝6）
3 結(jié)論
建立了快速測(cè)定血液、尿液中7 種抗凝血?dú)⑹笏幍脑诰€固相萃取／液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白質(zhì)，稀釋、離心和過(guò)濾后即可直接進(jìn)樣，與傳統(tǒng)的離線SPE 相比較，在線SPE 具有速度快、成本低、能自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)，克服了使用離線SPE 帶來(lái)的成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，大大提高了檢測(cè)通量。相較于傳統(tǒng)三維離子阱，二維線性離子阱內(nèi)的離子沿線性方向聚集，有效降低了空間電荷效應(yīng)，大大提升了阱內(nèi)離子容量，具備同時(shí)定性定量的能力；利用線性離子阱的這種性能，采用二級(jí)全掃描確證和子離子定量的方法，一針進(jìn)樣即可實(shí)現(xiàn)同時(shí)定性定量分析。該方法操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高，非常適合血液、尿液樣品中抗凝血?dú)⑹笏幍暮Y查與確證。
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黃克建 ， 盧敏萍， 周 哲， 林翠梧， 楊 寧， 劉曉鋒， 朱定姬，梁 平， 喬文濤， 李宏森， 李 璐， 黃曉青
（1. 廣西壯族自治區(qū)公安廳物證鑒定中心，廣西 南寧530012；2. 廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧530004；3. 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，上海201206；4. 廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院，廣西 南寧530021）
抗凝血?dú)⑹笏幨悄壳皬V泛使用的一類(lèi)慢性殺鼠藥，由4-羥基香豆素或茚二酮母體結(jié)構(gòu)衍生而來(lái)［1］?？鼓?dú)⑹笏庍M(jìn)入機(jī)體后，會(huì)拮抗維生素K1的活性，抑制肝臟產(chǎn)生凝血酶原及凝血因子，使凝血酶失去活性，同時(shí)提高毛細(xì)血管通透性和脆性，因而造成各臟器及黏膜大面積出血而死亡［2］。與急性殺鼠藥如毒鼠強(qiáng)相比，該類(lèi)慢性殺鼠藥由于具有廣譜、高效、適口性好、毒性相對(duì)較低、不易引起二次中毒且有特效解毒藥維生素K1 等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于室內(nèi)和野外殺鼠工作［3］。由于這類(lèi)藥物比較容易獲得，近年來(lái)人、家畜、野生動(dòng)物等中毒情況時(shí)有發(fā)生。目前，檢測(cè)生物樣品中抗凝血?dú)⑹笏幰殉蔀楣矙C(jī)關(guān)刑事技術(shù)部門(mén)日常主要任務(wù)之一。因此，建立一種快速檢測(cè)血液和尿液中抗凝血?dú)⑹笏幍姆椒ǎ蔀橹卸菊邔?duì)癥治療、公安機(jī)關(guān)立案?jìng)善萍霸V訟提供科學(xué)依據(jù)。
目前，抗凝血?dú)⑹笏幍臋z測(cè)方法主要有薄層色譜法（TLC）、紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）［3，4］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［5］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS／MS）［6-16］。TLC 和UV-Vis 檢測(cè)靈敏度低，難以滿(mǎn)足檢測(cè)要求；GC 和GC-MS 前處理耗時(shí)長(zhǎng)，衍生化過(guò)程復(fù)雜，且抗凝血?dú)⑹笏幫ǔＯ鄬?duì)分子質(zhì)量較大，部分甚至含有羥基，不易氣化，不宜用GC 和GC-MS 分析；HPLC 可以準(zhǔn)確檢測(cè)μg／mL、μg／g 級(jí)的樣品，但以色譜保留時(shí)間作為唯一定性指標(biāo)缺乏足夠的選擇性，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果［1］。而LC-MS／MS 則結(jié)合了色譜分離與質(zhì)譜結(jié)構(gòu)確證的優(yōu)勢(shì)，樣品前處理無(wú)須衍生化，可選擇多級(jí)離子掃描檢測(cè)，能同時(shí)進(jìn)行多組分的定性確證和定量分析，具有靈敏度高、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于抗凝血?dú)⑹笏幍臋z測(cè)中。由于尿液、血樣、組織等生物樣品的基質(zhì)成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)等基質(zhì)成分嚴(yán)重影響定性和定量結(jié)果；且樣品中的鹽不但會(huì)干擾質(zhì)譜分析的離子化過(guò)程，還會(huì)污染離子源，使靈敏度大大降低［17］。因此，在應(yīng)用LC-MS／MS 進(jìn)行定性與定量分析時(shí)，一般需要進(jìn)行樣品前處理，這是極為重要的環(huán)節(jié)，也常是最耗時(shí)、最困難的工作［18］?，F(xiàn)有的抗凝血?dú)⑹笏帢悠非疤幚矸椒ㄍǔ２捎玫鞍踪|(zhì)沉淀法［3］、液液萃取法［4，5，8-13］和離線固相萃取法（offline SPE）［6，7，14-16］等。這些方法均可起到富集、減少基質(zhì)干擾的作用，但存在操作繁瑣、步驟多、耗材成本高、重現(xiàn)性差、低通量等問(wèn)題。與傳統(tǒng)的液液萃取、離線固相萃取相比，近年發(fā)展起來(lái)的在線固相萃?。╫n-line SPE）技術(shù)顯著簡(jiǎn)化了樣品前處理工作，因具有自動(dòng)化程度高、富集效果好、樣品損耗低、SPE 柱可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在藥物分析、食品安全、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［18-20］。目前，尚未見(jiàn)關(guān)于抗凝血?dú)⑹笏幍脑诰€固相萃取前處理方法的報(bào)道。
本研究建立了在線固相萃取／液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜（on-line SPE／LC-LIT／MS）快速檢測(cè)血液、尿液中克滅鼠、殺鼠靈、殺鼠醚、敵鼠、氯敵鼠、溴敵隆和大隆7 種抗凝血?dú)⑹笏幍姆治龇椒ǎ瑸橹卸景福ㄊ拢┘目鼓獨(dú)⑹笏幍目焖俸Y查提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
DionexTMUltimate 3000TM雙三元液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），配備DGP-3600SD 脫氣機(jī)、TCC-3000SD 柱溫箱（帶六通閥）、WPS-3000TFC-ANALYTICAL 自動(dòng)進(jìn)樣器、MWD-3000 紫外檢測(cè)器。質(zhì)譜系統(tǒng)：LTQ XLTM型線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），配加熱電噴霧離子源（HESI-II）、XcaliburTM數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Mass Frontier 7.0TM軟件。3-18R 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)TOMOS 公司）；SB 3200-HT 超聲波清洗器（必能信上海有限公司）；Master-s UV 超純水發(fā)生器（上海和泰儀器有限公司）。
克滅鼠（coumafuryl，純度99.0%）、殺鼠醚（coumatetralyl，純度99.9%）、殺鼠靈（warfarin，純度97.2%）、敵鼠（diphacinone，純度98.0%）、氯敵鼠（chlorophacinone，純度98.9%）、溴敵?。╞romoadiolone，純度93.6%）和大?。╞rodifacoum，純度99.3%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純（美國(guó)Fisher 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
分別準(zhǔn)確稱(chēng)取7 種標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解定容，配制成200 μg／mL 的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-15 ℃下保存。使用時(shí)根據(jù)需要用乙腈稀釋?zhuān)渲瞥刹煌|(zhì)量濃度的單標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.2 在線固相萃取和色譜條件
在線SPE 柱：Waters Oasis?HLB（20 mm×3.9 mm，15 μm）。左泵為在線固相萃取泵，流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：甲醇。分析柱：Dionex AcclaimTMRSLC 120 C18（100 mm×3.0 mm，2.2 μm）。右泵為分析泵，流動(dòng)相A：0.02 mol／L 乙酸銨溶液；流動(dòng)相B：甲醇。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量50 μL；梯度洗脫條件及六通閥切換程序見(jiàn)表1，on-line SPE／HPLCMS 流路圖見(jiàn)圖1。
表1 梯度洗脫條件及六通閥切換程序Table 1 Gradient elution and valve switching programs
圖1 在線固相萃?。合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜的流路圖Fig.1 Diagram of on-line SPE／HPLC-MS
1.3 質(zhì)譜條件
電離方式為ESI 負(fù)離子模式；噴霧電壓為4 000 V；棱鏡電壓為85 V；氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣，其中鞘氣35 arb；輔助氣15 arb；氦氣用作碰撞氣；離子源溫度為300 ℃；毛細(xì)管溫度為350 ℃；隔離窗口為2 amu；采用保留時(shí)間鎖定目標(biāo)化合物二級(jí)子離子全掃描方式，分別記錄7 種抗凝血?dú)⑹笏幍亩?jí)子離子數(shù)據(jù)。保留時(shí)間鎖定窗口見(jiàn)圖2，主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
1.4 樣品處理
吸取0.5 mL 全血和尿液，分別置于10 mL 試管中，再分別加入1 mL 乙腈，然后渦旋振蕩1 min，隨后分別加入3.5 mL 乙酸銨水溶液（0.02 mol／L），超聲提取5 min 后在10 000 r／min 的轉(zhuǎn)速下離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，供LC-MS分析。
表2 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍闹饕|(zhì)譜參數(shù)Table 2 Main MS parameters of the seven anticoagulant rodenticides
圖2 7 種抗凝血?dú)⑹笏幫瑫r(shí)分析時(shí)的采集時(shí)間窗口Fig.2 Data acquisition time window for simultaneous analysis of the seven anticoagulant rodenticides
2 結(jié)果與討論
2.1 在線SPE 條件的優(yōu)化
選用合適的在線SPE 柱和設(shè)計(jì)合理的富集凈化和洗脫條件，是在線SPE 方法的關(guān)鍵［19］。本方法選用Waters Oasis?HLB 柱作為在線SPE 柱，該柱為反相保留機(jī)理，對(duì)酸性、中性和堿性化合物均具有吸附作用，富集效果好，是一種通用型萃取柱?？疾炝碎y切換時(shí)間對(duì)萃取的影響，用SPE 柱代替分析柱直接與質(zhì)譜檢測(cè)器連接，以水為流動(dòng)相，結(jié)果樣品中基質(zhì)流出SPE 柱所需的時(shí)間為3 min，閥切換時(shí)間應(yīng)晚于該時(shí)間，因此選擇在4 min 時(shí)將閥由1_2切換至6_1 狀態(tài)，既有效除去基質(zhì)干擾，又保證了目標(biāo)分析物有較高的萃取效率。
另外考察了分析柱流動(dòng)相中有機(jī)相的初始比例對(duì)目標(biāo)物洗脫和分離的影響。有機(jī)相初始比例高，可以將目標(biāo)物快速轉(zhuǎn)移至分析柱，但目標(biāo)物在短時(shí)間內(nèi)集中流出，不利于分離。實(shí)驗(yàn)最終選擇40% 的有機(jī)相初始比例，既可以有效避免色譜峰展寬問(wèn)題，提高響應(yīng)值，又可以使7 種殺鼠藥得到較好的分離。
2.2 分析柱的選擇
抗凝血?dú)⑹笏幹饕ㄜ釢M(mǎn)二酮類(lèi)和4-羥基香豆素類(lèi)兩種，其中敵鼠、氯敵鼠屬于前者，含有多個(gè)羰基構(gòu)成的酰亞胺結(jié)構(gòu)；溴敵隆、溴鼠靈、克鼠靈、殺鼠醚和殺鼠靈屬于后者，含有α，β-不飽和羰基及羥基，因此這7 種殺鼠藥均為弱酸性化合物，并有一定的極性。
考察了Hypersil GOLD C8、Hypersil GOLD C18 和AcclaimTMRSLC 120 C18 型分析柱對(duì)7 種殺鼠藥的保留作用，通過(guò)分析比較峰形、分離效果和響應(yīng)值，最終選擇AcclaimTMRSLC 120 C18 作為分析柱，7 種殺鼠藥的提取離子色譜圖見(jiàn)圖3。
圖3 7 種殺鼠藥的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of the seven anticoagulant rodenticides
2.3 流動(dòng)相的選擇
樣品中分析物的保留行為是分析物與固定相、流動(dòng)相相互作用的結(jié)果，因此流動(dòng)相選擇適當(dāng)與否對(duì)分析物的分離尤其重要。對(duì)乙腈-乙酸銨水溶液和甲醇-乙酸銨水溶液兩種體系進(jìn)行了考察，在相同條件下，采用甲醇-乙酸銨水溶液為分析流動(dòng)相時(shí)，7種殺鼠藥的響應(yīng)值明顯更高。以甲醇-乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，考察了甲酸對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.05% ～0.1% 時(shí)，7種殺鼠藥的峰形較寬，且均出現(xiàn)了不同強(qiáng)度的［MH＋68］-峰，推測(cè)為目標(biāo)物與甲酸鈉（HCOONa）結(jié)合形成的，其中敵鼠和氯敵鼠最為明顯，不但拖尾嚴(yán)重，還出現(xiàn)了較強(qiáng)的［M-H＋68］-峰；而流動(dòng)相不含甲酸時(shí)，7 種殺鼠藥色譜峰形對(duì)稱(chēng)，［M-H＋68］-峰消失，且敵鼠和氯敵鼠的［M-H］-響應(yīng)值比含甲酸情況下提高了10 倍以上?？赡茉蚴? 種殺鼠藥均為弱酸性化合物，其在酸性流動(dòng)相中形成分子態(tài)，不利于色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)，當(dāng)流動(dòng)相不加甲酸時(shí)，pH 高于分析物的pKa2 個(gè)單位以上，有利于色譜分離和提高分析物的離子化效率，7 種殺鼠藥的pKa值見(jiàn)表3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇甲醇和0.02 mol／L 乙酸銨水溶液為流動(dòng)相。
表3 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍膒Ka 值Table 3 pKa values of the seven anticoagulant rodenticides
2.4 基質(zhì)溶液酸堿性對(duì)萃取效率的影響
比較了基質(zhì)溶液pH 值分別為4.8、7.0 和9.2時(shí)7 種抗凝血?dú)⑹笏幍妮腿⌒Ч?。結(jié)果表明，在不同pH 值下均能萃取到7 種抗凝血?dú)⑹笏?，總體來(lái)說(shuō)酸性和中性條件下萃取效果比較好，堿性條件下雖然也能獲得較好的萃取效果，但重現(xiàn)性較差。結(jié)合流動(dòng)相考慮，最終選取0.02 mol／L 乙酸銨水溶液（pH 7.0）為樣品的稀釋液?；|(zhì)酸堿性對(duì)萃取效率的影響見(jiàn)圖4。
2.5 乙腈加入量對(duì)萃取效率的影響
圖4 基質(zhì)溶液pH 對(duì)萃取效率的影響Fig.4 Influence of pH value of matrix solution on extraction efficiency
血液和尿液樣品用SPE 處理時(shí)，常需加入有機(jī)溶劑來(lái)沉淀蛋白質(zhì)，以降低堵塞SPE 柱的風(fēng)險(xiǎn)。選取乙腈為蛋白沉淀劑，考察了基質(zhì)溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果如圖5 所示，基質(zhì)溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為5% ～45% 時(shí)均能萃取到藥物，綜合考慮后選擇添加20% 乙腈。
圖5 乙腈含量對(duì)萃取效率的影響Fig.5 Influence of volume percentage of acetonitrile on extraction efficiency
2.6 定量離子的選擇
本研究采用從二級(jí)全掃描信號(hào)中提取子離子進(jìn)行定量的方式，故二級(jí)離子的選擇對(duì)定量結(jié)果有重要的影響。對(duì)碎裂機(jī)理進(jìn)行研究，選擇高靈敏度和高專(zhuān)屬性的碎片作為定量離子。香豆素類(lèi)抗凝血?dú)⑹笏幰粋€(gè)較為常見(jiàn)的碎片為香豆素基團(tuán)形成的m／z 161 碎片，該碎片是克滅鼠和殺鼠靈的優(yōu)勢(shì)碎片，故選擇m／z 161 為兩者的定量離子；殺鼠醚、大隆的優(yōu)勢(shì)碎片都是脫去O-C＝O 基團(tuán)、中性丟失44 后形成的碎片離子，故分別選擇m／z 247 和m／z 477 為兩者的定量離子；溴敵隆因存在獨(dú)立羥基，優(yōu)勢(shì)碎片是由脫O-C＝O 和脫H2O 共同形成的m／z 463，選擇其作為定量離子。茚二酮基團(tuán)形成的m／z 145 離子是茚二酮類(lèi)抗凝血?dú)⑹笏幮纬傻闹饕槠?，在敵鼠和氯敵鼠的二?jí)質(zhì)譜圖中均可觀察到響應(yīng)較高的m／z 145 峰，但這兩個(gè)化合物的優(yōu)勢(shì)碎片是乙?；鶖嗔押笥啥交鶊F(tuán)形成的離子，這可能與二苯基可以更好地共軛電子有關(guān)，故分別選擇m／z 167 和m／z 201 為兩者的定量離子。各藥物的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式見(jiàn)圖6。
圖6 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍亩?jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.6 MS2and fragmentation patterns of the seven anticoagulant rodenticides
2.7 自建數(shù)據(jù)庫(kù)定性確證
在Mass Frontier 7.0 的Database Manager 中建立7 種抗凝血?dú)⑹笏幍囊合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，庫(kù)中包括化合物名稱(chēng)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、CAS 登錄號(hào)、結(jié)構(gòu)式、二級(jí)質(zhì)譜圖和保留時(shí)間等信息。進(jìn)行定性檢索時(shí)采用聯(lián)合組分檢測(cè)（Joint Components Detection）算法，對(duì)樣品數(shù)據(jù)中的組分進(jìn)行查找?；谒须x子輪廓圖最大值的統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)提取各個(gè)質(zhì)譜峰豐度輪廓圖，可創(chuàng)建出樣品中化合物的純凈質(zhì)譜樹(shù)，生成相應(yīng)的峰形，并自動(dòng)與庫(kù)中化合物的母離子、碎片離子和保留時(shí)間等信息匹配。在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，也能夠通過(guò)本方法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速準(zhǔn)確定性篩查。該數(shù)據(jù)庫(kù)為開(kāi)放體系，可在后續(xù)工作過(guò)程中不斷增加目標(biāo)化合物至數(shù)據(jù)庫(kù)中，為應(yīng)用的進(jìn)一步拓展提供了前景。
2.8 方法的線性范圍和檢出限
在空白血液和尿液中添加7 種抗凝血?dú)⑹笏幍幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液，得到0.10 ～1 000 ng／mL 系列樣品，按1.4 節(jié)方法進(jìn)行處理。以目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度C（ng／mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，繪制7 種殺鼠藥的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。采用逐步稀釋法進(jìn)行測(cè)試，以信噪比（S／N）≥3 確定檢出限（LOD），以S／N≥10 確定定量限（LOQ）。7 種殺鼠藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限等結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 7 種抗凝血?dú)⑹笏幍木€性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r2），limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the seven anticoagulant rodenticides
2.9 方法的加標(biāo)回收率及精密度
在空白血液和尿液中分別添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)溶液，按1.4 節(jié)方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度水平均平行測(cè)定6 次，考察方法的精密度和回收率（見(jiàn)表5）。
表5 全血和尿液中7 種抗凝血?dú)⑹笏幍募訕?biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 5 Recoveries and precisions of the seven anticoagulant rodenticides in whole blood and urine samples （n＝6）
3 結(jié)論
建立了快速測(cè)定血液、尿液中7 種抗凝血?dú)⑹笏幍脑诰€固相萃取／液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白質(zhì)，稀釋、離心和過(guò)濾后即可直接進(jìn)樣，與傳統(tǒng)的離線SPE 相比較，在線SPE 具有速度快、成本低、能自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)，克服了使用離線SPE 帶來(lái)的成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，大大提高了檢測(cè)通量。相較于傳統(tǒng)三維離子阱，二維線性離子阱內(nèi)的離子沿線性方向聚集，有效降低了空間電荷效應(yīng)，大大提升了阱內(nèi)離子容量，具備同時(shí)定性定量的能力；利用線性離子阱的這種性能，采用二級(jí)全掃描確證和子離子定量的方法，一針進(jìn)樣即可實(shí)現(xiàn)同時(shí)定性定量分析。該方法操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高，非常適合血液、尿液樣品中抗凝血?dú)⑹笏幍暮Y查與確證。
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