陳雨晴， 黃惠琴， 劉 敏， 鮑時翔*

(1.海南大學(xué) 環(huán)境與植物保護學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海南 ?？?571101)

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八門灣紅樹林土壤小單孢菌的分離及其多樣性

陳雨晴1,2， 黃惠琴2， 劉 敏2， 鮑時翔2*

(1.海南大學(xué) 環(huán)境與植物保護學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海南 ?？?571101)

采用平板稀釋法從海南八門灣紅樹林潮間帶、木果欖和海蓮紅樹根際土壤樣品中分離和篩選小單孢菌科放線菌，對其分離方法進行了評價和比較，并通過16S rRNA基因測序探索了八門灣紅樹林小單孢菌科放線菌的多樣性。采用4種預(yù)處理方法和5種分離培養(yǎng)基，經(jīng)過排除重復(fù)菌株后共得到115株放線菌。16S rRNA基因測序結(jié)果顯示，這些放線菌分布在5個科、9個屬。其中小單孢菌科的菌株約占全部菌株的90% (105株)，主要分布于3個屬：Micromonospora(85%)，Jishengella(9.5%)和Verrucosispora(5.5%)，與其親緣關(guān)系最近的菌株的相似性分布于98.5%～100%之間。

小單孢菌科；紅樹林； 多樣性；分離方法

放線菌是提取天然產(chǎn)物和抗生素的重要來源，近年來鏈霉菌的過度開發(fā)導(dǎo)致新型化合物的發(fā)現(xiàn)愈加困難，微生物也逐漸出現(xiàn)抗藥性變異，95%以上的活性物質(zhì)被證明為重復(fù)開發(fā)[1]，因此，急需尋找新的藥物來源來代替鏈霉菌。小單孢菌科( Micromonosporaceae ) 是一類具有多種生物活性的稀有放線菌，至2013年小單孢菌科內(nèi)被公認的屬共有27個[2]，是稀有放線菌中生產(chǎn)抗生素的最大來源[3]，小單孢菌科放線菌能產(chǎn)生特有的抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤等效果的抗生素[4]。由于小單孢菌科放線菌具有生長緩慢、難分離等特點，其挖掘深度遠遠不如真菌和鏈霉菌，但是該類群在土壤、水體、湖海沉淀物和植物根際中廣泛存在，具有廣闊的發(fā)展前景。紅樹林是分布于熱帶和亞熱帶的特殊海岸潮間帶生態(tài)系統(tǒng)，周期性受潮水侵蝕，并且具有高水分、高鹽分、寡營養(yǎng)等特點，蘊含極為豐富且極具特色的微生物資源[5]，研究表明，紅樹林的微生物多樣性優(yōu)于其他生境[6]，是產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物放線菌的重要來源[7]。本研究主要從海南八門灣紅樹林潮間帶、木果欖和海蓮紅樹根際采集土壤樣品，使用多種針對小單孢菌科放線菌的有效分離方法，對小單孢菌科放線菌進行分離，并通過16S rRNA基因測序?qū)膳囵B(yǎng)小單孢菌科放線菌的多樣性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的采集 于2012年11月，從海南文昌八門灣紅樹林(19°22′～19°35′ N, 110°4′～110°48′ E)潮間帶、海蓮與木果欖2種紅樹群落的紅樹根際，按照五點采樣法，分別采集0～5，5～10，10～20 cm深處土壤樣品，均勻混合后裝入無菌袋內(nèi)，并置入冰盒中于4 h內(nèi)帶回實驗室處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 小單孢菌科放線菌分離培養(yǎng)基: HV，M1 (可溶性淀粉10 g，干酪素0.3 g，KNO32 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL, pH 7.2)，M7 (天冬氨酸0.1 g，蛋白胨2 g，丙酸鈉4 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4)，土壤浸汁瓊脂，幾丁質(zhì)瓊脂，純化培養(yǎng)基為ISP2。在分離培養(yǎng)基中均加入過濾除菌的100 μg/mL重鉻酸鉀、100 μg/mL放線菌酮、10 μg/mL萘啶酮酸，以抑制細菌和真菌的生長；培養(yǎng)基中以70%陳海水和30%蒸餾水代替原配方中100%蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 土壤樣品均采用5種預(yù)處理方法：干熱(A)：土壤樣品自然風(fēng)干后120 ℃干熱處理1 h；風(fēng)干加苯酚(B)：土壤樣品自然風(fēng)干后加入1.5%苯酚，30 ℃水浴30 min[8]；風(fēng)干加濕熱(C)：土壤樣品自然風(fēng)干后55 ℃濕熱處理6 min；濕熱(D)：未風(fēng)干土壤樣品55 ℃濕熱處理6 min。

1.2.2 放線菌分離 將1 g預(yù)處理后土壤樣品稀釋于10 mL無菌陳海水中，180 r/min震蕩30 min，靜置20 min后取上清液，采用平板稀釋法稀釋至10-2、10-3和10-4，各取100 μL涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度3次重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～8周，待長出明顯菌落后，挑選形態(tài)特征不同于鏈霉菌的單菌落劃線于ISP2培養(yǎng)基上直至菌株純化。

1.2.3 16S rRNA測序與分析 采用核酸提取儀提取菌株基因組 DNA為模板，PCR擴增使用放線菌通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCMTGCCTCAG-3′)和1492r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)有限公司直接測序。測序結(jié)果經(jīng)處理后提交至EzTaxon核酸序列庫(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)進行比對，利用MEGA5.0軟件進行多序列比對，Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 小單孢菌科放線菌的分離

采用選擇性分離培養(yǎng)法及5種培養(yǎng)基共分離295株類似小單孢菌科放線菌菌株，經(jīng)初步形態(tài)學(xué)排除重復(fù)菌株，篩選到115株放線菌，通過16S rRNA基因序列測定，105株屬于小單孢菌科。分別統(tǒng)計4種預(yù)處理方式和5種培養(yǎng)基分離菌株的數(shù)量，不同的培養(yǎng)基和處理方法對分離小單孢菌科放線菌數(shù)量的影響見圖1和圖2。

由圖1可知， HV培養(yǎng)基分離得到小單孢菌科放線菌的數(shù)量最多，約占總菌株數(shù)量的39%；M1和土壤浸汁瓊脂分離效果相當，各占 24%和21%， M7培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)瓊脂培養(yǎng)基共分離得到16%的小單孢菌科放線菌菌株。

圖1 培養(yǎng)基對分離小單孢菌科放線菌分離數(shù)量的影響Fig.1 Number of Micromonosporaceae strains isolated by different media

預(yù)處理方式也是影響菌株分離數(shù)量的一大因素。由圖2可知，通過預(yù)處理C分離到小單孢菌科放線菌92株(占總數(shù)的88%)，是本實驗中分離數(shù)量最多的預(yù)處理方法；預(yù)處理B和D分離菌株的數(shù)量較少，分別為3株和9株，而方法A僅得到1株小單孢菌科放線菌。

圖2 預(yù)處理方法對分離小單孢菌科放線菌分離數(shù)量的影響Fig.2 Number of Micromonosporaceae strains isolated by different pre-treatment methods

A：風(fēng)干加干熱；B：風(fēng)干加苯酚；C：風(fēng)干加濕熱；D：濕熱

A：air drying and dry heat;B:air drying and wet-heating with phemol;

C:air drying and wet-heating;D:wet-heating

2.2 可培養(yǎng)小單孢菌科放線菌的多樣性

將16S rRNA基因測序結(jié)果和數(shù)據(jù)庫中菌株序列進行系統(tǒng)發(fā)育相似性的比對，初步鑒定分離所得115株放線菌分布在5個科(Thermomonospraceae、Geodermatophilaceae、Gordoniaceae、Streptosporangiaceae和Micromonosporaceae)、9個屬(Actinomadura、Blastococcus、Rhodococcus、Nonomuraea、Microbiospora、Streptosporangium、Micromonospora、Jishengella和Verrucosispora)，其中小單孢菌科放線菌約占全部菌株的90% (約105株)，主要分布于3個屬：Micromonospora(85%)、Jishengella(9.5%)和Verrucosispora(5.5%)。由此可見，以上3個屬在八門灣紅樹林土壤可培養(yǎng)小單孢菌科放線菌中占主要優(yōu)勢；菌株的最大同源性分布于98.5%～100%之間，同源性小于99%的菌株約占全部菌株的29.5%(31株)。105株菌株的16S rRNA基因序列比對結(jié)果見表1。

表1 分離菌株與模式菌株的16S rRNA序列比對結(jié)果

分別在以上21個類群中選取代表序列，將序列上傳至GenBank，登錄號為KJ467023～KJ467043，根據(jù)序列同源性從高到低的順序選取25株代表菌，利用Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

圖3 基于16S rRNA的21株菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 21 strains and related strains based on 16S rRNA

3 討 論

目前小單孢菌科放線菌的傳統(tǒng)分離方法主要以提供小單孢菌科放線菌適宜的生長條件和抑制快速增長的非目的菌為原則[9]，對土壤樣品進行預(yù)處理目的是排除非目的菌干擾，同時最大程度地保留小單孢菌科放線菌。風(fēng)干1～3周可有效減少細菌和鏈霉菌數(shù)量，并且小單孢菌科放線菌分離效果良好，但也會對部分種類造成影響；55 ℃濕熱處理6 min有利于放線菌孢子萌發(fā)，分離菌株數(shù)量較多。培養(yǎng)基也是影響菌株分離的重要因素，其中碳、氮源是主要影響因素，如腐植酸、酪蛋白和幾丁質(zhì)等對包括小單孢菌科放線菌在內(nèi)的稀有放線菌的生長具有促進作用[10]。根據(jù)本研究的結(jié)果，建議將HV、土壤浸汁和M1培養(yǎng)基混合使用，并且在土壤浸汁瓊脂上由于營養(yǎng)較匱乏，菌株普遍生長緩慢，延長培養(yǎng)時間至8周能防止部分種類的遺漏。分離自幾丁質(zhì)培養(yǎng)基的菌株經(jīng)初步鑒定，種類多為除小單孢菌科放線菌以外的稀有放線菌，可適用于非鏈霉菌資源的開發(fā)。通過改進方法，本研究與以前研究相比，能有效排除鏈霉菌的干擾，分離得到小單孢菌科放線菌的比例大幅增加，并且得到種類也比較豐富。

張曉敏[2]的研究表明小單孢菌科放線菌的分布趨向于溫和、營養(yǎng)含量高并且具有適當濕度的條件，且部分小單孢菌屬具有典型的地域分布特點。王成[11]對海南文昌頭苑紅樹林的23種紅樹植物的根際土壤選擇性分離并鑒定的30株小單孢菌科放線菌均屬于Micromonospora，并分屬于9個種。洪亮等[12]從海南清瀾港、儋州、湛江、深圳等7處不同紅樹林土壤樣品共分離得到127株小單孢菌科放線菌，主要屬于Micromonospora、Actinoplanes和Verrucosispora三個屬。本研究選擇了八門灣紅樹林潮間帶和2種主要紅樹根際土壤作為實驗樣品，分離的小單孢科放線菌主要分布于3個屬：Micromonospora、Jishengella和Verrucosispora，Micromonospora在數(shù)量上顯著高于小單孢菌科內(nèi)其他屬，并且在各地紅樹林生境中都占有一定的優(yōu)勢；而其他菌群則具有地域分布的特點，如分離于海南紅樹林老鼠簕(Acanthusillicifolius)根際底泥的Jishengella[13]可能為海南紅樹林中特有的優(yōu)勢菌群，廣泛分布于海洋生境如海綿、海底沉積物和泥炭沼中的Verrucosispora[14]作為一種能產(chǎn)生多種抗生素的放線菌，在本實驗分離的菌株中也占有一定優(yōu)勢。

現(xiàn)代放線菌分類以16S rRNA核苷酸序列分析為中心，一般來說，如果相似性在97%以下可以定為新種[15]。但在小單孢菌科中，菌株間相似性要高于其他放線菌，如Koch等[16]研究發(fā)現(xiàn)小單孢菌科中16S rRNA基因序列的相似性普遍在98%～99%之間，疣孢菌屬(Verrucosispora)中VerrucosisporamarisDSM 45365(T)與VerrucosisporagifhornensisDSM 44337(T)之間的相似性更是高達99.7%[17]。本研究中相似性低于99%的菌株可被視為潛在新種，有待進一步驗證。

[1] Berdy J. Bioactive microbial metabolites [J]. The Journal of antibiotics, 2005, 58(1): 1-26.

[2] 張曉敏,劉秋,劉限.小單孢菌科研究進展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,41(9):175-185.

[3] Lazzarini A, Cavaletti L, Toppo G, et al. Rare genera of actinomycetes as potential producers of new antibiotics[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2000, 78(3-4): 399-405.

[4] Bull A T, Stach J E M. Marine actinobacteria: new opportunities for natural product search and discovery[J]. Trends in microbiology, 2007, 15(11): 491-499.

[5] Hywel-Jones N L. Biodiversity of Tropical Microfungi[J]. Hong Kong University Press, 1996, 86: 57-69.

[6] Alongi D M. Bacterial productivity and microbial biomass in tropical mangrove sediments[J]. Microbial Ecology, 1988, 15(1): 59-79.

[7] Hong K, Gao A H, Xie Q Y, et al. Actinomycetes for marine drug discovery isolated from mangrove soils and plants in China[J]. Marine drugs, 2009, 7(1): 24-44.

[8] Takizawa M, Colwell R R, Hill R T. Isolation and diversity of actinomycetes in the Chesapeake Bay[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(4): 997-1002.

[9] Tiwari K, Gupta R K. Diversity and isolation of rare actinomycetes: an overview[J]. Critical Reviews in Microbiology, 2013 39(3): 256-294.

[10]Tiwari K, Gupta R K. Rare actinomycetes: a potential storehouse for novel antibiotics[J]. Critical reviews in biotechnology, 2012, 32(2): 108-132.

[11]王成. 文昌紅樹林根際土壤小單孢菌的分離與菌株211018的鑒定[D]. 海南大學(xué),2010.

[12]沈振國. 紅樹林環(huán)境 Micromonosporaceae 的分離, 初步鑒定及活性評價[D]. 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[13]Xie Q Y, Wang C, Wang R, et al.Jishengellaendophyticagen. nov., sp. nov., a new member of the family Micromonosporaceae[J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2011, 61(5): 1153-1159.

[14]Rheims H, Schumann P, Rohde M, et al.Verrucosisporagifhornensisgen. nov., sp. nov., a new member of the actinobacterial family Micromonosporaceae[J]. International journal of systematic bacteriology, 1998, 48(4): 1119-1127.

[15]Stackebrandt E, Goebel B M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1994, 44(4): 846-849.

[16]Koch C, Kroppenstedt R M, Rainey F A, et al. 16S ribosomal DNA analysis of the generaMicromonospora,Actinoplanes,Catellatospora,Catenuloplanes,Couchioplanes,Dactylosporangium, andPilimeliaand emendation of the family Micromonosporaceae[J]. International journal of systematic bacteriology, 1996, 46(3): 765-768.

[17]Goodfellow M, Stach J E M, Brown R, et al.Verrucosisporamarissp. nov., a novel deep-sea actinomycete isolated from a marine sediment which produces abyssomicins[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2012, 101(1): 185-193.

Isolation of Micromonosporaceae from Mangrove Soil in Bamen Bay & Its Diversity

CHEN Yu-qing1, 2, HUANG Hui-qin2, LIU Min2, BAO Shi-xiang2

(1.Envir. &PlantProtect.Coll.,HainanUni.,Haikou570228; 2.KeyLab．ofBiol. &GeneticRes．ofTropicalCrops,Minist.ofAgric.,Inst.ofTropicalBio-Sci. &Biotech.,CATAS;Haikou571101)

Micromonosporaceae actinomycetes were isolated and screened from soil samples collected from rhizospheric soil ofXylocarpusmekongensisandBruguierasexangulain Wenchang Bamen Bay of Hainan intertidal zone adopting dilution-plate method, and the isolation methods were valuated and compared, and the diversity of Micromonosporaceae actinomycetes in Bamen Bay mangrove forest were investigated with 16S rRNA gene sequencing. Four pre-treatment approaches and five isolation media were used, a total of 115 actinomycetes strains were obtained after removing the repetitive strains. The 16S rRNA gene sequencing results showed that these 115 actinomycetes belonged to 5 families and 9 genera. Among them Micromonosporaceae strains accounted for 90% of the total (105 strains), and mainly distributed in three genera:Micromonospora(85%),Jishengella(9.5%), andVerrucosispora(5.5%), and the similarities of the strain with the nearest osculation distributed from 98.5% to 100%.

Micromonosporaceae; mangrove; diversity; isolation method

國家支撐計劃(2012BAC18B04)；國家海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目(廈海漁合2013-18號)；海南省重大科技項

陳雨晴 女，碩士研究生。研究方向為微生物資源與利用。E-mail:chenyuqingmz@126.com

* 通訊作者。男，研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向為微生物資源與利用。Tel: 0898-66988564，E-mail:bsxitbb@ 163.com

2014-03-02；

2014-04-15

Q939.13+9；Q78

A

1005-7021(2015)01-0006-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.002

目(ZDZX2013023-1)