冠突散囊菌液體培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

郭勁霞， 鄒自征*， 劉 蓉， 歐陽方丹， 文 敏

(益陽醫(yī)學高等?？茖W校，湖南益陽 413002)

摘要[目的]研究冠突散囊菌(Eurotium cristatum)液體培養(yǎng)條件。[方法] 采用L16(45)正交試驗設計，對影響冠突散囊菌生長的主要因素，包括黑茶濃度、蔗糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度和接種量進行5因素4水平篩選分析。[結(jié)果] 冠突散囊菌最優(yōu)的液體培養(yǎng)條件為：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養(yǎng)溫度為29 ℃，接種量為1%(孢子濃度為6.0×108cfu/ml)。[結(jié)論]該研究可為現(xiàn)代發(fā)酵工程技術應用于茯磚茶生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

關鍵詞冠突散囊菌(Eurotium cristatum);茯磚茶;正交設計;體系優(yōu)化

中圖分類號S571.1

作者簡介郭勁霞(1970- )，女，湖南益陽人，副教授，從事生化營養(yǎng)研究。*

收稿日期2015-07-22

Optimization of Liquid Culture Conditions ofEurotiumcristatumUsing Orthogonal Design

GUO Jin-xia, ZOU Zi-zheng*, LIU Rong et al (Yiyang Medical School, Yiyang, Hunan 413002)

Abstract[Objective] To study the liquid culture conditions of Eurotium cristatum.[Method] Using L16(45) orthogonal design to analyze the main factors that affect the growing of Eurotium cristatum, including the concentration of black tea, sugar concentration, pH, temperature and inoculation quantity level.[Result] The best culture conditions were 0.7% black tea juice, 5% glucose, pH 5, culture temperature 29 ℃, inoculation quantity 1% (the concentration of spore was 6.0×108 cfu/ml).[Conclusion] The study provides scientific basis for applying the modern fermentation technology in the production of Fuzhuan tea.

Key wordsEurotiumcristatum; Fuzhuan tea; Orthogonal design; System optimization

黑茶是我國的特有茶類，經(jīng)過長時間的渥堆發(fā)酵，茶葉色澤轉(zhuǎn)化為黑褐色或黑色，故稱黑茶[1]。我國西北地區(qū)干燥缺水，居民以肉食、乳酪為主食，缺少蔬菜、水果，黑茶具有消滯、減肥、止渴的作用，又便于攜帶與保存[2]，因此，黑茶成為了邊疆牧民的“生命之飲”。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬，呈金黃色，俗稱“金花菌”，是茯磚茶在特定溫、濕度條件下，通過“發(fā)花”工藝長成的自然益生菌體[3]。冠突散囊菌與茯磚茶獨特品質(zhì)和各種保健作用的形成具有十分重要的聯(lián)系。“金花”菌吸收茶葉中營養(yǎng)成分，經(jīng)生物酶的催化生產(chǎn)諸多對人體有益的成分，包括酶和小分子代謝產(chǎn)物，具有促消化、降血脂、調(diào)節(jié)人體免疫功能等作用[4-5]，因此“金花”菌生長越旺盛，茶葉品質(zhì)則越好[5-8]。此外，有研究表明，冠突散囊菌絲體富含15種氨基酸，其中包括所有的人體必需氨基酸[5,8]。

冠突散囊菌的培養(yǎng)主要集中在固體培養(yǎng)基上，液體培養(yǎng)少有報道，筆者采用正交設計的方法對冠突散囊菌液體培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，為黑茶制作工藝的改良提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料茯磚茶：由湖南益陽茶廠提供；冠突散囊菌：益陽醫(yī)學高等?？茖W校實驗室保存。

1.2試驗方法

1.2.1黑茶浸提液的制備 。參考鄧放明的方法[9]配制1.0%的黑茶提取液備用。

1.2.2冠突散囊菌孢子懸液制備。實驗室保存的冠突散囊菌復蘇，復壯，用接種環(huán)將菌刮下，置于無菌水中，Vortex混勻(約10 min)，制備成濃度為6.0×108cfu/ml菌株懸液。

1.2.3影響冠突散囊菌生長因子的正交設計。采用L16(45)正交試驗設計，對影響冠突散囊菌生長的主要因素，包括黑茶濃度、蔗糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度和接種量進行5因素4水平篩選分析，共16個處理，每個處理3次重復(表1)。500 ml三角瓶(每瓶裝培養(yǎng)液200 ml)置于旋轉(zhuǎn)式搖床，培養(yǎng)96 h，測定菌絲干重。

表1　冠突散囊菌培養(yǎng)的因素水平L 16(4 4)正交試驗設計

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析數(shù)據(jù)分析采用The SAS System for Windows 8.0進行方差分析。

2結(jié)果與分析

利用統(tǒng)計軟件SAS 8.0對統(tǒng)計結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表2。

2.1試驗重復性檢測該試驗獨立重復3次，從表2可以看出，第1、2和3次的重復的均值分別為0.269、0.267和0.267，無統(tǒng)計學差異，表明該試驗重復性好。

2.2黑茶用量對冠突散囊菌生長的影響試驗結(jié)果表明(圖1)，黑茶濃度增加有利于冠突散囊菌生長。黑茶用量在0.7%以下，其差異顯著(P<0.05)，黑茶用量在0.7%以上，菌絲干重變化不顯著。因此，考慮到成本問題，黑茶最佳濃度為0.7%。

表2　各因素、水平對冠突散囊菌生長的影響

注：同一行不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 圖1　黑茶濃度對菌絲干重的影響

2.3蔗糖濃度對冠突散囊菌生長的影響試驗結(jié)果表明(圖2)，蔗糖濃度對冠突散囊菌生長呈現(xiàn)一種類似倒鐘型曲線關系。蔗糖濃度在5%以下，隨蔗糖用量增加，菌絲干重增加；蔗糖濃度為5%時，菌絲干重最高2.93 g/L;蔗糖濃度超過7%時，菌絲干重下降顯著?？赡苁请S著蔗糖濃度增加，培養(yǎng)基滲透壓也相應增大，對冠突散囊菌生長有一定抑制作用。因此，考慮到成本問題，蔗糖最佳濃度為5%。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 圖2蔗糖濃度對菌絲干重的影響

2.4發(fā)酵液初始pH對冠突散囊菌生長的影響與圖2的結(jié)果類似，pH對冠突散囊菌的生長同樣呈現(xiàn)倒鐘型曲線，其最適pH為5(圖3)。pH能影響到蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而影響菌內(nèi)酶活性，過酸過堿，酶活性都會降低，這點試驗結(jié)果與理論完全吻合。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 圖3　pH對菌絲干重的影響

2.5溫度對冠突散囊菌生長的影響試驗結(jié)果表明(圖4)，溫度對冠突散囊菌生長具有雙重效應，在29 ℃以下時，增加溫度，菌絲干重也顯著增加(P<0.05)；一旦超過29 ℃，增加溫度，菌絲干重迅速降低?？赡艿脑蚴菧囟戎苯佑绊懙焦谕簧⒛揖富钚浴Ｒ虼?，冠突散囊菌的最適溫度為29 ℃。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 圖4　溫度對菌絲干重的影響

2.6接種量對冠突散囊菌生長的影響從圖5可以看出，1.0%的接種量菌絲干重最高，1.5%與2.0%接種量之間差異不顯著，且與1.0%的結(jié)果差異顯著(P<0.05)，0.5%的接種量菌絲干重最低，可能高濃度菌絲接種量可能會導致真菌產(chǎn)生相互抑制。最后確定最佳接種濃度為1.0%。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 圖5　接種量對菌絲干重的影響

綜上所述，正交分析結(jié)果，液體培養(yǎng)體系中，其最優(yōu)條件：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養(yǎng)溫度為29 ℃，接種量為1%(孢子濃度為6.0×108cfu/ml)。

2.7最優(yōu)結(jié)果的確認根據(jù)最優(yōu)結(jié)果對冠突散囊菌進行培養(yǎng)，重復3次，菌絲干重均值為3.674 g/L，高于正交試驗的每次處理值，達到了優(yōu)化的目的。

3結(jié)論與討論

微生物液體發(fā)酵技術的概念是20世紀40年代由美國弗吉尼亞大學生物工程專家Elmer L，Gaden.Jr提出，并設計出培養(yǎng)微生物系統(tǒng)的生物反應器，H.Humfeld、 S.Block博士、J.Szuess等人相繼改進并成熟。該項技術具有原料來源廣、成本低、生產(chǎn)周期短、工業(yè)化生產(chǎn)、無季節(jié)性等特點，適合自然條件下難以培養(yǎng)的珍稀菌種。

微生物液體發(fā)酵的過程復雜，受到很多因素的影響，找出關鍵因素，并將其優(yōu)化，是工程技術人員首要解決的問題。

該研究采用多因素正交試驗方法，對影響冠突散囊菌液體發(fā)酵的主要因素進行了研究，確定了冠突散囊菌液體發(fā)酵的最佳液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，液體培養(yǎng)體系中，其最優(yōu)條件：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養(yǎng)溫度為29 ℃，接種量為1%(孢子濃度為6.0×108cfu/ml)。該培養(yǎng)體系的建立，為冠突散囊菌的培養(yǎng)以及黑茶的研究奠定了技術和理論基礎。

參考文獻

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