江西遂川地區(qū)禽流感和新城疫病毒的監(jiān)測研究

耿海東1，2，金洪梅1，張延君3，張小林1，張佳潔1，李 祥1，周長宇1，丁圓英1，高光雨1，王卓樂1，喬 丹1，李吟雪1，翟熙文1，華育平1，張國鋼4*，柴洪亮1*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.國家林業(yè)局野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測總站，遼寧沈陽110034；3.中國野生動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)，秦皇島野生動(dòng)物救護(hù)中心，河北秦皇島066100; 4.全國鳥類環(huán)志中心，中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100091)

摘要[目的]了解江西遂川地區(qū)野生鷺科鳥類攜帶禽流感和新城疫病毒的感染情況。[方法] 于2014年10月在江西省遂川地區(qū)采集鷺科鳥類的肛拭子110份、咽拭子110份，采用SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，通過血凝試驗(yàn)篩選出疑似陽性樣品，然后再用RT-PCR進(jìn)行鑒定。[結(jié)果] 在110份被檢樣品中，除4份樣品外，其余樣品的血凝效價(jià)均為0。經(jīng)RT-PCR檢測，所有樣品禽流感和新城疫病毒檢測結(jié)果均呈陰性。這表明2014年秋季江西遂川地區(qū)野生鷺科鳥類發(fā)生禽流感和新城疫病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)較小。[結(jié)論] 該研究可為了解江西各地區(qū)野生水禽禽流感和新城疫的感染情況提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞禽流感；新城疫；監(jiān)測

中圖分類號S855

基金項(xiàng)目林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404404)；國家林業(yè)局野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測項(xiàng)目。

作者簡介耿海東(1960- )，男，遼寧大連人，高級工程師，從事野生動(dòng)物疫病學(xué)研究。金洪梅(1990- )，女，吉林通化人，碩士研究生，研究方向：野生動(dòng)物流行病學(xué)。張延君(1986- )，男，河北秦皇島人，助理工程師，碩士，從事野生動(dòng)物救護(hù)工作。耿海東、金洪梅和張延君為同等貢獻(xiàn)作者。 *通訊作者，柴洪亮，副教授，博士，從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。*通訊作者，張國鋼，副研究員，博士，從事鳥類生物學(xué)研究。

收稿日期2015-07-29

Monitoring of Avian Influenza and Newcastle Disease Virus in Suichuan Region of Jiangxi Province

GENG Hai-dong1,2, JIN Hong-mei1, ZHANG Yan-jun3, ZHANG Guo-gang4*, CHAI Hong-liang1*et al(1.College of Wildlife Resources, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. General Monitoring Station for Wildlife-borne Infectious Diseases,State Forestry Administration,Shenyang, Liaoning 110034; 3. Qinghuangdao Center for Wildlife Rescue and Protection, China Wildlife Conservation Association, Qinghuangdao, Hebei 066100; 4. National Bird Tagging Center, Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration, Beijing 100091)

Abstract[Objective] The research aimed to investigate the epidemiological characteristics of avian Influenza and newcastle disease virus of wild Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province. [Method] 110 oropharyngeal and 110 cloacal swabs of Ardeid birds were collected from Suichuan Region of Jiangxi Province in October of 2014. The viruses were separated by using SPF chicken embryos and suspected positive samples were screened out by hemagglutination test and identified by RT-PCR. [Result] Among 110 detected samples，hemagglutination titer of other samples was 0 except 4 samples. The detection results of RT-PCR showed that the detection samples of avian Influenza and newcastle disease virus of all samples were negative. This indicated that the infection risk of avian Influenza and newcastle disease of Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province in the summer of 2014 was small. [Conclusion] The research could provide basic data for understanding the infection situations of avian Influenza and newcastle disease of wild water birds in each region of Jiangxi Province.

Key wordsAvian influenza; Newcastle disease; Monitoring

鳴謝湖北省野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測中心及黑龍江省林業(yè)廳等為該研究提供了相關(guān)試驗(yàn)和技術(shù)支持，特此致謝。

新城疫(Newcastle disease，ND)，也稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的以禽類消化道、呼吸道損傷為主要特征的一種急性、高度接觸性、烈性傳染病，常呈敗血癥經(jīng)過。雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等多種家禽及野禽均易感染，人類也可以感染此病毒[1]。可以引起易感雞群呼吸困難、甩頭、流涎、神經(jīng)紊亂、產(chǎn)蛋率下降等癥狀以及氣管出血、腺胃乳頭出血、腸道淋巴結(jié)組織有棗核狀潰瘍灶等病理變化[2-3]。該病流行于世界各國，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害和威脅世界的養(yǎng)禽業(yè)，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)列為 A 類疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。目前，新城疫已成為嚴(yán)重危害我國養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴(yán)重?fù)p失。

禽流感(Avian influenza，AI)又稱歐洲雞瘟或者真性雞瘟，是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的以感染禽類為主的高度接觸性傳染病，均屬于A型流感病毒[4-5]。按照病原體類型的不同，禽流感可分為高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大類。其中，高致病性禽流感被國際獸醫(yī)局(OIE)定性為A類烈性傳染病，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為甲類監(jiān)測傳染病，而且被列入國際生物武器公約動(dòng)物源傳染病名單[6-7]。禽流感的每次爆發(fā)都帶來了極其巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害了世界各國禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。據(jù)報(bào)道，2005年12月15日江西省遂川縣曾發(fā)生H5N1亞型高致病性禽流感疫情。江西遂川縣泉江鎮(zhèn)上溪村某農(nóng)戶飼養(yǎng)的鴨出現(xiàn)死亡，共死亡鴨1 640只，而這一疫情帶來的相繼撲殺工作給當(dāng)?shù)厝嗽斐闪藝?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2013年12月江西省出現(xiàn)了人感染H10N8的病例。因此，對江西遂川地區(qū)野鳥攜帶和感染禽流感病毒和新城疫病毒的調(diào)查就顯得尤為重要。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1SPF雞胚。SPF雞胚，購自維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.2主要試劑。Trizol，購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自PROMEGA公司；Taq酶與dNTP，購自GenStar公司；RRI，購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1樣品來源。在江西遂川地區(qū)主要采用活捕法(包括網(wǎng)捕法和籠捕法)捕捉到110只野生鷺科鳥類。每只鷺都采集咽拭子和肛拭子樣品，樣品共220份。置于拭子病毒保存液中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病毒的分離。采用雞胚尿囊腔接種法進(jìn)行病毒增殖。同一樣品編號的處理后的咽拭子、肛拭子保存液上清各取0.1 ml，混合接種于9～11日齡SPF雞胚尿囊腔，每個(gè)樣品接種1枚SPF雞胚，37 ℃全自動(dòng)孵化器內(nèi)孵育72 h，每隔12 h照胚觀察1次。棄去24 h以內(nèi)的死亡雞胚，無菌環(huán)境下收獲24～72 h內(nèi)的死胚及活胚的尿囊液。所有樣品經(jīng)過雞胚傳代3次后，對收集的尿囊液進(jìn)行血凝(HA)試驗(yàn)，測定血凝效價(jià)，并對HA陽性樣品進(jìn)行AIV和NDV的RT-PCR檢測。

1.2.3病毒RNA的提取。①取200 μl HA陽性樣品的尿囊夜于離心管中，加入600 μl裂解液，混合振蕩90 s；②靜置5 min后加入200 μl三氯甲烷，混勻振蕩，靜置2 min后12 000 r/min 4 ℃離心10 min；③取450 μl上清液于新的離心管中，加入450 μl異丙醇，混勻，室溫沉降10 min，12 000 r/min 4 ℃下離心10 min；④棄上清，加入1 000 μl 75%酒精，12 000 r/min 4 ℃下離心10 min；⑤棄上清，干燥沉淀，加10 μl DEPC水進(jìn)行溶解；⑥加2 μl反轉(zhuǎn)錄引物，70 ℃水浴5 min，冰上冷卻5 min。⑦加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，RNA酶抑制劑0.5 μl，DEPC水3 μl，2.5 mmol/L的dNTP 4 μl和5×buffer 5 μl后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。⑧反轉(zhuǎn)錄后的核酸存放于-20 ℃條件下。

1.2.4RT-PCR檢測。在PCR管中依次加入10×Buffer 2 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2 μl，上、下游引物各1 μl(20 pmol/μl)，TaqDNA聚合酶0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5 μl，補(bǔ)雙蒸水至25 μl進(jìn)行PCR(每個(gè)血凝陽性樣品都要檢測禽流感和新城疫病毒)。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、退火溫度下30 s、72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。其中，AIV的退火溫度為50 ℃，NDV的退火溫度為53.1 ℃。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1血凝效價(jià)對采集的尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)。由表1可知，在110份被檢樣品中有4份有血凝試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，其余血凝效價(jià)均為0。

表1　血凝試驗(yàn)結(jié)果

2.2RT-PCR檢測結(jié)果提取尿囊液中的病毒核酸為模板，使用自己設(shè)計(jì)的AIV鑒定引物和NDV鑒定引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從圖1～2可以看出，AIV陽性對照樣品的目的片段大小為960 bp，NDV陽性對照樣品的目的片段大小為375 bp。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)AIV陽性對照樣品出現(xiàn)960 bp的目的片段，NDV陽性對照樣品出現(xiàn)375 bp的目的片段，待檢的血凝陽性樣品未出現(xiàn)相應(yīng)的目的片段。由此可見，待檢的血凝樣品的AIV和NDV檢測結(jié)果均為陰性。

注：M.DL2000 Marker；1.陰性對照；2～5為血凝陽性樣品；6.陽性對照。 圖1　樣品AIV的PCR檢測結(jié)果

注：M.DL2000 Marker；1.陽性對照；2～5為血凝陽性樣品；6.陰性對照。 圖2　樣品NDV的 PCR檢測結(jié)果

3討論

新城疫在世界范圍內(nèi)曾有過3次大流行。目前，該病在我國各地普遍存在，并且是我國養(yǎng)禽業(yè)危害最大、經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的禽病之一[8]。禽流感也是嚴(yán)重危害和威脅我國乃至全世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的A類疫病，每次暴發(fā)都會(huì)給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。江西省遂川縣被稱為“遂川鳥道”，是全國三大候鳥遷徙通道之一，是我國華中地區(qū)遷徙鳥類的必經(jīng)“隘口”，是遷徙鳥類往返俄羅斯、我國北方地區(qū)與東南亞，乃至澳大利亞和新西蘭等路線上的關(guān)鍵點(diǎn)之一。候鳥在遷徙活動(dòng)中，存在于候鳥體內(nèi)的禽流感病毒或新城疫病毒將有可能在遷徙過程中進(jìn)行傳播。候鳥群中存在的呈低致病性的禽流感病毒有可能通過家禽與野生鳥類接觸，傳染給家禽，在家禽中重組和變異，導(dǎo)致高致病性禽流感( HPAI)病毒的產(chǎn)生。自1959 年以來，在世界范圍內(nèi)這種由野生鳥類中的LPAI 傳染給家禽，在家禽中變異成為HPAI，最終導(dǎo)致疫情

的多次暴發(fā)[9]。由此可見，對這個(gè)地區(qū)禽流感和新城疫病毒的監(jiān)測將有利于預(yù)測與此通道相關(guān)地區(qū)疫情的暴發(fā)情況。

筆者對江西省遂川地區(qū)野生鷺科鳥類進(jìn)行了樣品采集，對這批樣品禽流感和新城疫病毒的鑒定結(jié)果均為陰性。這可能有以下原因：①在采集樣品后未能及時(shí)放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存，在運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室過程中可能溫度過高造成了病毒的損失。②可能是因?yàn)椴杉瘶悠愤^少，病毒量太低而未能檢測出來。雖然通過該試驗(yàn)將不能充分了解江西各地區(qū)野生水禽感染禽流感和新城疫流行情況，但可為今后進(jìn)一步研究提供有價(jià)值的信息和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳建華，秦卓明，孫梅，等. 一株新城疫強(qiáng)毒株的分離鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(12)：111-113.

[2] 蔡寶祥. 家畜傳染病學(xué)[M].4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：304-309.

[3] B·M·卜爾尼克. 禽病學(xué)[M].10版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：691-792.

[4] JAHANGIR A，RUENPHET S，SHOHAM D，et al.Phenotypic，genetic，and phylogeographical characterization of avian influenza virus subtype H5N2 isolated from northern pintail(Anasacuta)in Japan[J].Virus research，2009，145(2)：329-333.

[5] CHAHARAEIN B.Detection of H5，H7 and H9 subtypes of avianinfluenza viruses by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction[J].Microbiological research，2009，164：174-179.

[6] B·W·卡爾尼克.禽病學(xué)[M].9版.北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991.

[7] 甘孟侯.全球禽流感的流行形勢[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26(6)：468-471.

[8] 由軒，謝曉峰，楊鵬飛.中俄邊境地區(qū)野生候鳥禽流感的流行病學(xué)調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011(11)：117-118.

[9] 崔治中.我國新城疫流行現(xiàn)狀[J].中國家禽，2002，24(4)：4-6.