不同施用模式下高效氯氰菊酯對(duì)滑菇生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

周小倩，李文莉，趙 珍，張菀苓，符婷婷，王繼華*

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150025)

摘要[目的]了解施用不同濃度的高效氯氰菊酯對(duì)滑菇生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，以確定實(shí)際生產(chǎn)中該藥劑施用的最佳稀釋倍數(shù)。[方法]采用控制變量法，研究不同濃度的4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對(duì)滑菇C3-1和滑菇RH的菌絲體生物量、蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率等的影響。[結(jié)果]施用不同濃度的4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對(duì)滑菇的生長(zhǎng)狀態(tài)都有顯著抑制作用，且抑制作用大小不同。當(dāng)稀釋倍數(shù)為4 000時(shí)，4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對(duì)滑菇C3-1和滑菇RH的生長(zhǎng)都有相對(duì)較強(qiáng)的抑制作用；當(dāng)稀釋倍數(shù)為8 000時(shí)，滑菇RH的生長(zhǎng)量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均相對(duì)較高，均僅次于對(duì)照組；當(dāng)稀釋倍數(shù)為12 000時(shí)，滑菇C3-1的生長(zhǎng)量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均較高。[結(jié)論]綜合分析，在保證高效氯氰菊酯除蟲(chóng)滅菌的藥效情況下，4.5%乳油狀高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)以8 000～12 000倍為宜，此時(shí)藥劑的使用對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響最小。

關(guān)鍵詞施用模式；高效氯氰菊酯；滑菇；影響

中圖分類(lèi)號(hào)S436.46

基金項(xiàng)目大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310231023)。

作者簡(jiǎn)介周小倩(1988- )，女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，研究方向：微生物遺傳學(xué)與微生物生態(tài)學(xué)。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物遺傳學(xué)研究。

收稿日期2015-07-24

Effect of Different Concentrations of Beta-cypermethrin on Growth ofPholiotanameko

ZHOU Xiao-qian，LI Wen-li，ZHAO Zhen，WANG Ji-hua*et al(School of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin, Heilongjiang 150025)

Abstract[Objective] In order to make sure the optimal diluted multiples of beta-cypermethrin in production, effect of different concentrations of beta-cypermethrin on growth of Pholiota nameko was studied. [Method] Effects of different concentrations of 4.5% beta-cypermethrin EC on mycelium biomass, protein content and superoxide anion clearance of Pholiota nameko C3-1 and RH strains were studied by using the control variable method. [Result] The application of different concentrations of efficient 4.5% beta-cypermethrin EC had certain inhibitory effect on growth of Pholita nameko. When the diluted multiples were 4 000, 4.5% beta-cypermethrin EC had more strong inhibitory effect on growth of Pholita nameko C3-1 and RH strains. When the diluted multiples were 8 000, Pholita nameko RH had relatively high mycelium biomass, protein content and superoxide anion clearance, next to control. When the diluted multiples were 12 000, Pholita nameko C3-1 had relatively high mycelium biomass, protein content and superoxide anion clearance. [Conclusion] Under the conditions of ensuring control efficiency of 4.5% beta-cypermethrin EC, the suitable diluted multiples of 4.5% beta-cypermethrin EC were 8 000-12 000, and had the least effect on the growth of Pholiota nameko.

Key wordsConcentration; Beta-cypermethrin;Pholiotanameko; Effect

滑子菇(Pholiotanameko)別名珍珠菇、滑菇、光帽鱗傘，在日本地區(qū)被稱(chēng)為納美菇，臺(tái)灣地區(qū)叫“珍珠菇”，屬無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱、傘菌目、絲膜菌科[1]?；庸皆a(chǎn)于日本，后在我國(guó)黑龍江、遼寧等地進(jìn)行人工大規(guī)模培養(yǎng)。其表面附著一層滑嫩可口、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的黏多糖，蛋白質(zhì)含量高于香菇和平菇，并且低熱量、低脂肪，目前已成為世界上五大宗人工栽培的食用菌之一。但在人工栽培過(guò)程中，食用菌極易染菌，病蟲(chóng)害發(fā)生頻繁，所以要使用農(nóng)藥[2-5]。高效氯氰菊酯是一種新型的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑，其組成成分主要為氯氰菊酯的高效體，在分子結(jié)構(gòu)與生物活性方面類(lèi)似于天然除蟲(chóng)菊酯的仿生農(nóng)藥，具有殺蟲(chóng)廣譜、高效、低毒、低殘留、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，所以許多菇農(nóng)選用高效氯氰菊酯作為滑菇栽培的殺蟲(chóng)劑。但如果藥劑使用不當(dāng)，就會(huì)引起殺蟲(chóng)效果較差或藥害，造成損失。因此，找出有效的施用濃度是非常有必要的。為此，筆者測(cè)定了5種濃度梯度下高效氯氰菊酯對(duì)滑菇的影響，以期為滑菇生產(chǎn)過(guò)程中合理施用殺蟲(chóng)劑提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥劑。4.5%乳油狀高效氯氰菊酯由江蘇揚(yáng)農(nóng)化工集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2供試菌。菌株為篩選出的優(yōu)勢(shì)菌滑菇C3-1和滑菇RH，由哈爾濱師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3培養(yǎng)基。液體PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，1 000 ml蒸餾水。

1.1.4試劑。BCA標(biāo)準(zhǔn)樣品小牛血清蛋白、苯酚、濃硫酸、乙醇、NaCl、鄰苯三酚、鹽酸溶液和Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)均為分析純。

1.2方法

1.2.1加藥方式。為模擬菇房養(yǎng)殖的真實(shí)情況，首先活化接種滑菇優(yōu)勢(shì)菌滑菇C3-1和滑菇RH，接種于固體PDA斜面培養(yǎng)基上，菌絲體在20 ℃培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)。12 d后取0.5 cm2菌絲體接種于液體PDA培養(yǎng)基上。根據(jù)滑菇C3-1和滑菇RH的實(shí)際生長(zhǎng)情況，在其生長(zhǎng)最快的時(shí)間點(diǎn)將不同濃度梯度的高效氯氰菊酯加入液體PDA培養(yǎng)基中。由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得知，滑菇C3-1在第12天生長(zhǎng)速度最快，所以在相同培養(yǎng)條件下，在滑菇C3-1遮光培養(yǎng)第12天加入不同濃度的高效氯氰菊酯進(jìn)行試驗(yàn)。滑菇RH則在第14天生長(zhǎng)速度最快，所以將第14天作為后期加入藥劑的時(shí)間點(diǎn)。

1.2.2加藥培養(yǎng)基的配制。配制液體PDA培養(yǎng)基，將液體培養(yǎng)基定量100 ml分裝于三角瓶中，121 ℃滅菌30 min，冷卻后分別向其中接入0.5 cm2培養(yǎng)于固體PDA培養(yǎng)基中的菌絲體，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)藥劑的使用說(shuō)明和前期的文獻(xiàn)調(diào)查[6-8]，將滑菇C3-1在20 ℃下遮光培養(yǎng)至12 d、滑菇RH在20 ℃下遮光培養(yǎng)至14 d時(shí)，分別加入稀釋倍數(shù)為4 000、8 000、12 000、16 000及20 000的高效氯氰菊酯，以培養(yǎng)基中加入等量無(wú)菌水作為空白對(duì)照組(CK)，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)至16 d。

1.2.3滑菇生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。反映滑菇生長(zhǎng)情況指標(biāo)有很多，通過(guò)對(duì)滑菇的生長(zhǎng)量、營(yíng)養(yǎng)成分中蛋白質(zhì)的含量以及超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定來(lái)評(píng)定不同濃度高效氯氰菊酯對(duì)其生長(zhǎng)指標(biāo)的影響，且用具體數(shù)據(jù)的變化直觀(guān)反映出滑菇的生長(zhǎng)情況。

1.2.3.1滑菇生長(zhǎng)量。將20 ℃恒溫遮光培養(yǎng)至18 d的菌絲體在烘箱中烘干至恒重后，測(cè)定菌絲體干重。

1.2.3.2菌絲體蛋白質(zhì)含量。采用考馬斯亮藍(lán)法[9-11]。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)：稱(chēng)取0.1 g標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品小牛血清蛋白(BSA)置于10 ml蒸餾水中，搖勻；按不同比例配制成不同濃度的蛋白溶液(表1)；取5.0 ml配制好的考馬斯亮藍(lán)G250溶液與配制好的不同濃度的蛋白質(zhì)樣液混勻，倒入比色杯中，用分光光度計(jì)測(cè)量其在595 nm波長(zhǎng)下的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。稱(chēng)取加入不同濃度高效氯氰菊酯的滑菇菌絲體各0.1 g，加入1.0 ml生理鹽水，在組織研磨器中將菌絲體研磨至組織破碎成勻漿狀后，4 ℃浸提3 h，12 000 r/min離心10 min，取其上清得到粗蛋白提取液。將蛋白粗提液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)?dāng)粗提液稀釋30倍后適用考馬斯亮藍(lán)法，測(cè)定OD值，再與標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)作對(duì)照，計(jì)算每個(gè)樣品中蛋白質(zhì)的含量。

表1　標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)中不同濃度蛋白質(zhì)配比　ml

1.2.2.3超氧陰離子自由基清除率。分別將5.0 ml提前研磨好的組織研磨液和1.4 ml Tris-HCl緩沖溶液(pH 9.0)加入到大試管中，在25 ℃恒溫水浴中預(yù)熱20 min，向其中一支試管加入恒溫水浴已預(yù)熱的0.8 ml 30 mmol/L鄰苯三酚溶液，另一支不加。分別用水稀釋至25.0 ml，在室溫下反應(yīng)15 min，然后于25 ℃恒溫水浴反應(yīng)4 min，反應(yīng)完全向其中滴入2滴10 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。以水為參比，測(cè)定325 nm波長(zhǎng)處體系的吸光度。設(shè)不加鄰苯三酚時(shí)體系的吸光度為A1，加入鄰苯三酚后體系的吸光度為A2，則超氧自由基產(chǎn)生量可用ΔA=A1-A2表示。計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中，A0表示不含研磨液的吸光值；A1表示含有研磨液但不含鄰苯三酚的吸光值；A2表示含研磨液又含鄰苯三酚的吸光值[12-13]。

2結(jié)果與分析

2.1高效氯氰菊酯對(duì)滑菇生長(zhǎng)量的影響由圖1可知，低稀釋倍數(shù)高效氯氰菊酯的使用下滑菇C3-1生長(zhǎng)量較低，高濃度的高效氯氰菊酯對(duì)滑菇的生長(zhǎng)有一定抑制作用，在稀釋倍數(shù)為12 000和16 000時(shí)，滑菇C3-1的生長(zhǎng)量有明顯回升，幾乎接近對(duì)照組(CK)，而稀釋倍數(shù)為20 000時(shí)生長(zhǎng)量又有所降低。

由圖2可知，施用高效氯氰菊酯后對(duì)滑菇的生長(zhǎng)有一定的抑制，當(dāng)稀釋倍數(shù)為4 000時(shí)，該藥劑對(duì)滑菇RH生長(zhǎng)狀態(tài)的抑制作用最強(qiáng);稀釋倍數(shù)為8 000時(shí)，滑菇RH的生長(zhǎng)量?jī)H次于對(duì)照組；在稀釋倍數(shù)為12 000、16 000、20 000時(shí)生長(zhǎng)量均低于稀釋倍數(shù)為8 000時(shí)，變化幅度很小，表明當(dāng)該藥劑稀釋8 000倍時(shí)，滑菇RH的生物量最高。

圖1　高效氯氰菊酯不同稀釋倍數(shù)下滑菇C3-1菌絲體的生長(zhǎng)量

圖2　高效氯氰菊酯不同稀釋倍數(shù)下滑菇RH菌絲體的生物量

2.2高效氯氰菊酯對(duì)滑菇蛋白質(zhì)含量的影響標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。蛋白質(zhì)線(xiàn)性回歸方程為y=0.006 9x+0.124 9,R2=0.995,線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖3　蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由圖4和圖5可知，當(dāng)稀釋倍數(shù)為0時(shí)，滑菇C3-1和滑菇RH蛋白質(zhì)含量都最高，分別為21.8%和22.3%。高效氯氰菊酯的使用對(duì)蛋白質(zhì)有一定的抑制作用。其中，當(dāng)高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)為4 000時(shí)，滑菇C3-1蛋白質(zhì)含量?jī)H為10.3%。隨著稀釋倍數(shù)的增大，當(dāng)高效氯氰菊酯的稀釋倍數(shù)為12 000時(shí)蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)至19.5%，達(dá)到施用高效氯氰菊酯后的最高點(diǎn)，而在稀釋倍數(shù)為16 000和20 000時(shí)，蛋白質(zhì)含量降低，分別為16.7%和17.1%，說(shuō)明當(dāng)稀釋倍數(shù)為12 000時(shí)，既能達(dá)到消除蟲(chóng)害又能最小地影響蛋白質(zhì)的含量。對(duì)滑菇RH而言，在高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)為4 000倍時(shí)，蛋白質(zhì)含量較對(duì)照組明顯下降，為17.8%；當(dāng)稀釋倍數(shù)為8 000時(shí)蛋白質(zhì)含量達(dá)到施用藥劑的最高含量，為18.9%，僅次于對(duì)照組；之后隨著稀釋倍數(shù)的增加滑菇蛋白質(zhì)的含量反而下降，說(shuō)明稀釋倍數(shù)為8 000是最佳的施藥倍數(shù)，能達(dá)到較好的效果。

圖4　不同稀釋倍數(shù)高效氯氰菊酯處理后滑菇C3-1蛋白質(zhì)含量

圖5　不同稀釋倍數(shù)高效氯氰菊酯處理后滑菇RH蛋白質(zhì)含量

2.3高效氯氰菊酯對(duì)滑菇超氧陰離子清除率的影響由圖6可知，在空白對(duì)照組稀釋倍數(shù)為0時(shí)，超氧陰離子自由基的清除率最高為52.4%；在加入稀釋倍數(shù)為12 000的高效氯氰菊酯時(shí)，超氧陰離子自由基清除率較其他稀釋倍數(shù)高；在稀釋倍數(shù)為4 000時(shí)，超氧陰離子自由基的清除率最低，而在稀釋倍數(shù)為16 000和20 000時(shí)，也有較高的超氧陰離子自由基清除率。

由圖7可知，除對(duì)照組外，當(dāng)高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)為4 000時(shí)超氧陰離子自由基的清除率最低，為21.0%；當(dāng)稀釋倍數(shù)為8 000時(shí)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到了施用高效氯氰菊酯的最高值，為45.0%；之后隨稀釋倍數(shù)的增加超氧陰離子自由基清除率下降。

圖6　不同稀釋倍數(shù)高效氯氰菊酯處理后滑菇C3-1超氧陰離子自由基清除率

圖7　不同稀釋倍數(shù)高效氯氰菊酯處理后滑菇RH超氧陰離子自由基清除率

3討論

研究農(nóng)藥的施用對(duì)食用菌生長(zhǎng)情況的影響時(shí)，瓊脂培養(yǎng)皿法是常用的方法。該研究改良了常規(guī)實(shí)驗(yàn)室采用的瓊脂培養(yǎng)皿法來(lái)測(cè)定農(nóng)藥對(duì)食用菌菌絲體生長(zhǎng)狀況的影響，以菌絲體在液體PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長(zhǎng)最快點(diǎn)加藥的方式作為研究點(diǎn)，既避免了由于高壓滅菌而導(dǎo)致高效氯氰菊酯揮發(fā)失效的弊端，又減少了菌絲體培養(yǎng)初期對(duì)藥物敏感的影響，使得研究結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

該研究通過(guò)對(duì)不同稀釋倍數(shù)的高效氯氰菊酯施用下的滑菇C3-1和滑菇RH的生長(zhǎng)量、蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定來(lái)衡量其生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明，在稀釋倍數(shù)為4 000時(shí)，高效氯氰菊酯的濃度較高，對(duì)滑菇C3-1和滑菇RH菌絲體的生長(zhǎng)量、蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均為濃度梯度中的最低值，表明低濃度的高效氯氰菊酯對(duì)滑菇菌絲體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，所以將農(nóng)藥稀釋到4 000倍并非最佳選擇。當(dāng)高效氯氰菊酯的稀釋倍數(shù)為12 000時(shí)，滑菇C3-1的生長(zhǎng)量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基的清除率均相對(duì)較高。對(duì)于滑菇RH來(lái)說(shuō)，當(dāng)高效氯氰菊酯的稀釋倍數(shù)為8 000倍時(shí)，生長(zhǎng)量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均相對(duì)較高，綜合3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果分析，在保證高效氯氰菊酯除蟲(chóng)滅菌的藥效情況下，將4.5%乳油狀高效氯氰菊酯稀釋8 000～12 000倍，藥劑的使用對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)影響最小。因此，建議菇農(nóng)在生產(chǎn)過(guò)程中將農(nóng)藥稀釋成適當(dāng)倍數(shù)再施用，既能達(dá)到除蟲(chóng)滅菌的目的，又能保證滑菇的生長(zhǎng)質(zhì)量。

由于是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定的4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對(duì)滑菇菌絲體生長(zhǎng)情況的影響，可能對(duì)試驗(yàn)有一定的限制，至于稀釋的藥劑濃度對(duì)滑菇子實(shí)體形成與生長(zhǎng)的影響，有待實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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