茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)及其分化培養(yǎng)研究

宋 剛，曹 正，宋金耀，戚海玲，謝正林

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，江蘇句容 212400)

摘要[目的] 研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)茅蒼術(shù)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響。 [方法]采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的最優(yōu)培養(yǎng)條件。[結(jié)果]最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)方法：以葉片為外植體，反面朝下接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA。愈傷組織分化不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為1/2MS +4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA。[結(jié)論]為茅蒼術(shù)組培快繁技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞茅蒼術(shù);正交試驗(yàn);愈傷組織;不定芽

中圖分類號(hào)S503.53

基金項(xiàng)目江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)科研項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介宋剛(1978-)，男，江蘇鹽城人，副教授，在讀博士，從事植物生理、植物組織培養(yǎng)研究。

收稿日期2015-07-29

Study on Callus Induction and Differentiation Culture ofAtractylodeslancea

SONG Gang, CAO Zheng, SONG Jin-yao et al(Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry,Jurong, Jiangsu 212400)

Abstract[Objective] The aim was to study the effect of different plant growth regulator on induction and differentiation of different explant callus.[Method] By L9 (34) orthogonal experiment design, the optimal culture conditions of callus induction and differentiation were studied. [Result] The best induction culture method was: with leaf as explant, the opposite face vaccination in culture medium, culture medium formula was MS + 2.0 mg/L 2, 4-D + 1.0 mg/L NAA. The optimal combination for callus differentiation adventitious bud was 1/2 MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.4 mg/L NAA. [Conclusion] The study laid a foundation for rapid propagation technology and cell culture technology of Atractylodes lancea.

Key wordsAtractylodeslancea; Orthogonal experiment; Callus; Adventitious bud

茅蒼術(shù)(Atractylodeslancea)為菊科多年生草本植物，其根莖具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效[1]，為臨床常用藥之一。茅蒼術(shù)主要產(chǎn)于江蘇、湖北、浙江及安徽等地，傳統(tǒng)上以江蘇省茅山一帶為中藥材茅蒼術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)，包括現(xiàn)今江蘇省南京、句容和金壇等地，歷代本草專著均認(rèn)為其質(zhì)量好、療效佳，曾作為貢品享譽(yù)全國(guó)[2-3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)茅蒼術(shù)化學(xué)成分及其藥理學(xué)研究表明，茅蒼術(shù)根莖主要含有蒼術(shù)素等活性成分；此外，還含有多糖、糖苷等一些水溶性活性成分以及鐵、鋅、鎂、鈣等多種人體必需的微量元素[4]，具有保肝、抗心率失常、降血糖、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。近年來(lái)因山地開(kāi)墾和過(guò)度采挖，蒼術(shù)野生資源日趨枯竭，通過(guò)組織培養(yǎng)不僅能夠擴(kuò)大繁殖，增加茅蒼術(shù)產(chǎn)量，還可以在此基礎(chǔ)上選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的道地茅蒼術(shù)新品種，增加種植茅蒼術(shù)的比較效益，對(duì)緩解供需矛盾、保護(hù)野生茅蒼術(shù)資源具有重要意義。通過(guò)組織培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗，為大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)和繁殖種苗提供有效途徑。有關(guān)茅蒼術(shù)組織培養(yǎng)的研究較少。巢建國(guó)等[5]是最早涉及這方面研究的，他們用茅蒼術(shù)胚根、胚軸、子葉、真葉為外植體誘導(dǎo)獲得了完整的再生植株。

通常植物組織培養(yǎng)獲得再生植株多采用間接器官發(fā)生途徑，切取植株外植體在合適的條件下誘導(dǎo)愈傷組織，再篩選出生長(zhǎng)情況較好的愈傷組織進(jìn)行分化成苗。筆者通過(guò)研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)茅蒼術(shù)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，以期為茅蒼術(shù)組培快繁技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1外植體。來(lái)自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院組培中心以茅蒼術(shù)種子無(wú)菌播種培養(yǎng)[6]得到的無(wú)菌苗。

1.1.2培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂7.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH調(diào)至5.8～6.2，高壓蒸汽法滅菌，121 ℃，20 min。

1.1.3植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，NAA(萘乙酸)，KT(激動(dòng)素)，6-BA(6-芐氨基嘌呤)，配成相應(yīng)濃度的母液。

1.2方法

1.2.1茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。 考察不同外植體和3種不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。

表1　茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)因素水平　mg/L

將茅蒼術(shù)無(wú)菌苗葉片切成0.3 cm×0.3 cm大小，葉柄切成0.3～0.5 cm小段，葉片外植體每個(gè)培養(yǎng)皿接種10個(gè)，葉柄外植體每個(gè)培養(yǎng)皿接種20個(gè)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。接種時(shí)葉片分為朝上和朝下2個(gè)方向，葉片和葉柄均平鋪在培養(yǎng)基表面，略微用力使其與培養(yǎng)基充分接觸。培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃,光照1 500～3 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

每7 d統(tǒng)計(jì)一次愈傷組織誘導(dǎo)率，21 d后結(jié)束統(tǒng)計(jì)。

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

1.2.2茅蒼術(shù)愈傷組織分化培養(yǎng)。選用常用的生長(zhǎng)素NAA和細(xì)胞分裂素6-BA作為培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。由于不能確定這兩因素是否獨(dú)立影響，所以需要考慮兩因素間的交互作用。通過(guò)上述分析，設(shè)計(jì)了L9(34)正交試驗(yàn)考察NAA和6-BA 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基成分對(duì)愈傷組織分化出芽的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2　 茅蒼術(shù)愈傷組織分化正交試驗(yàn)因素水平　mg/L

接種時(shí)選取生長(zhǎng)旺盛、大小5 mm×5 mm的愈傷組織，均勻分布接種在分化培養(yǎng)基上，每瓶接種4塊,每處理7瓶。培養(yǎng)基附加瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L， pH 5.8。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx。21 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的出芽率。

2結(jié)果與分析

2.1不同因素對(duì)茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)的影響培養(yǎng)7 d左右，各外植體缺口處開(kāi)始出現(xiàn)半透明的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顏色逐漸變?yōu)辄S綠色和黃白色，數(shù)量也越來(lái)越多。培養(yǎng)21 d后各處理的愈傷組織誘導(dǎo)率見(jiàn)表3。

表3　不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)茅蒼術(shù)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，外植體的來(lái)源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響最大，極差值達(dá)到44.17。其次是2，4-D，在3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中其極差最大，達(dá)到40.84。說(shuō)明除外植體因素重要外，2,4-D的濃度變化對(duì)誘導(dǎo)茅蒼術(shù)愈傷組織也較重要，與陶金華等[7]研究結(jié)果一致。在3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中，KT的濃度變化對(duì)茅蒼術(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)影響最小。3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響大小為2，4-D、NAA、KT，也進(jìn)一步說(shuō)明作為生長(zhǎng)素的2，4-D和NAA在誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生過(guò)程中比作為細(xì)胞分裂素的KT作用大，這符合生長(zhǎng)素作用主要是用于誘導(dǎo)愈傷組織形成、根的分化及細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)的原理[8]。

茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件為A1B3C1D2,即在MS培養(yǎng)基中加入2.0 mg/L的2,4-D和1.0 mg/L的NAA，采用葉片反面朝下接種的方式。

2.2不同因素對(duì)茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響培養(yǎng)7 d開(kāi)始統(tǒng)計(jì)不定芽出芽率，21 d后各處理的出芽率見(jiàn)表4。

表4　茅蒼術(shù)外植體愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽正交試驗(yàn)

由表4可知，各因素(及互作)對(duì)愈傷組織出芽率的影響的極差值以A×B最大，其后依次為B、C，最后是A，即各因素(及互作)影響的主次為A×B、B、C、A。對(duì)出芽率影響最大的是6-BA和NAA的互作。而且6-BA×NAA的R值超過(guò)了6-BA、NAA單獨(dú)添加的影響，表明A與B的不同水平搭配對(duì)出芽率的影響最大。用A與B的雙向搭配表進(jìn)一步分析，結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可以看出，A、B間最優(yōu)的搭配是A2B1和A3B2組合，出芽率均為100.0%。雖然從單因素結(jié)果考察，A因素3個(gè)水平優(yōu)劣為A1、A2、A3，但由于交互作用的影響，應(yīng)選擇A2和A3。B因素最優(yōu)水平是B2，C因素最優(yōu)水平是C2，因此，最優(yōu)水平組合是A3B2C2。

表5　A×B搭配

由此可知，茅蒼術(shù)愈傷組織分化不定芽的最佳培養(yǎng)基配方組合為A3B2C2， 即1/2MS +4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA。

3 結(jié)論與討論

3.1結(jié)論該研究中茅蒼術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件是MS培養(yǎng)基中加入2.0 mg/L的2,4-D和1.0 mg/L的NAA，采用葉片為外植體、反面朝下接種的方式。茅蒼術(shù)愈傷組織分化不定芽的最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS +4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA。

3.2討論前人對(duì)蒼術(shù)的組織培養(yǎng)研究表明，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)蒼術(shù)組織培養(yǎng)有重要影響。2,4-D是植物組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一，一定濃度的2,4-D能促進(jìn)植物愈傷組織的誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)效果較好[9-11]。在誘導(dǎo)植物愈

傷組織時(shí)，2,4-D也通常與其他植物生長(zhǎng)素類或細(xì)胞分裂素類物質(zhì)一起使用，聞麗等[12]用2,4-D和NAA成功誘導(dǎo)了油茶的愈傷組織，在該試驗(yàn)中也證實(shí)了2,4-D和NAA對(duì)促進(jìn)茅蒼術(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)有較好的效果。

適宜的外植體有助于愈傷組織的誘導(dǎo)[7]。該試驗(yàn)中，茅蒼術(shù)不同外植體葉片正面、葉片反面和葉柄均可誘導(dǎo)出愈傷組織，但效果差異明顯。平均誘導(dǎo)率以葉片反面最高，其次是葉片正面，最后是葉柄。筆者認(rèn)為，葉片正反面都有切口與培養(yǎng)基接觸，葉柄只有一端接觸培養(yǎng)基，所以誘導(dǎo)率較低。另外，茅蒼術(shù)葉為異面葉，正反面存在極性差異，這可能是兩面誘導(dǎo)率不同的原因之一，在其他植物組培研究中也觀察到此種現(xiàn)象[13-14]。

6-BA是植物愈傷組織分化中的重要植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。單獨(dú)使用6-BA可使植物愈傷組織得以分化，與其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配合使用效果更好[15-16]，該試驗(yàn)中6-BA和NAA互作影響確實(shí)高于6-BA和NAA單獨(dú)使用結(jié)果。

以上討論表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是植物愈傷組織誘導(dǎo)和分化的重要因素。盡管其作用特點(diǎn)已知，但由于外植體所取部位的差異，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑劑量的選擇以及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用時(shí)配比是探討高效率進(jìn)行植物愈傷組織誘導(dǎo)和分化的關(guān)鍵所在。其次，外植體的選擇在植物愈傷組織誘導(dǎo)和分化過(guò)程中也具有重要作用。

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