甘西鼠尾草ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

李文淵， 王津慧， 童 麗， 熱增才旦， 楊 芳， 索南鄧登

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，青海西寧 810001)

摘要采用單因素試驗(yàn)和4因素3水平的正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，建立和優(yōu)化甘西鼠尾草穩(wěn)定的ISSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明，甘西鼠尾草20 ul ISSR-PCR體系中各因素的最佳濃度：10×Buffer(Mg2+)2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。

關(guān)鍵詞甘西鼠尾草；ISSR-PCR；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)S567.23+9

基金項(xiàng)目青海省科技廳項(xiàng)目(2011-N-F19);青海大學(xué)中青年科研

作者簡(jiǎn)介李文淵(1983- )，女，青海西寧人，講師，碩士，從事中藏藥資源研究。

收稿日期2015-08-03

Establishment and Optimization ofSalviaprzewalskiiMaxim. ISSR-PCR Reaction System

LI Wen-yuan, WANG Jin-hui, TONG Li et al (Medical College of Qinghai University, Xining , Qinghai810001)

AbstractUsing the single factor test and the 4 factors and 3 level orthogonal test, the ISSR-PCR reaction system and amplification program for Salvia przewalskii Maxim were established. The study showed that the optimum concentration for each factor in 20 μl ISSR-PCR reaction system were 10×Buffer(Mg2+)2 μl, dNTPs 0.4 mmol/L, Tag enzyme 1.0 U, primer 0.3 μmol/L, DNA30ng.

Key wordsSalviaprzewalskiiMaxim; ISSR-PCR; Optimization

甘西鼠尾草(SalviaprzewalskiiMaxim.)又名高原丹參，是藏區(qū)常用的藏藥(藏文譯音：吉子恩保)，因其有效成分與中藥丹參相似，功能主治亦與丹參相同，在西南、西北地區(qū)甘西鼠尾草普遍作為臨床治療心血管疾病中藥丹參的替代品種[1]。

近年來(lái)ISSR技術(shù)已應(yīng)用于植物遺傳分析的各個(gè)方面，如品種鑒定[2]、遺傳關(guān)系及遺傳多樣性分析[3-4]、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[5-7]等研究。為確保ISSR分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化非常必要。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。甘西鼠尾草材料，采自青海省及甘肅省8個(gè)不同的居群。

1.1.2主要試劑與儀器。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB))(國(guó)藥集團(tuán))、三羥甲基氨基甲烷(Tris)Solarbio、β-巰基乙醇(AMRESCO)、EDTA(國(guó)藥集團(tuán))、SDS(國(guó)藥集團(tuán))、溴化乙錠(EB)Sigma、瓊脂糖(GENETECH)，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。Tag酶、dNTP(Mg+)、10×buffer(TaKaRa)、ISSR引物由上海生工公司合成。冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精科)、 凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)、電泳儀( 北京市六一儀器廠)、水浴鍋( 東方電工)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取。以甘西鼠尾草為材料，用改良CTAB法提取DNA。采用1.5%瓊脂糖電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，-20 ℃保存。

1.2.2ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化。隨機(jī)抽取一樣品的DNA作為模板，ISSR-PCR擴(kuò)增體系為：在20 μl中，內(nèi)含20 ng模板DNA，1.0U Tag聚合酶，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，2 μl的10×Buffer(內(nèi)含Mg+)。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，在引物退火溫度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

為了優(yōu)化反應(yīng)體系，針對(duì)DNA、dNTPs、TagDNA酶和引物用量等，設(shè)置了一系列的濃度梯度，進(jìn)行單因素試驗(yàn)(表1)，為進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系，進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(34)(表2)。

表1　ISSR-PCR反應(yīng)體系的因素水平

表2　ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) L 9(3 4)

2結(jié)果與分析

2.1模板DNA用量對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響由圖1可知，在20 μl反應(yīng)體系中，模板DNA濃度在10～50 ng均能擴(kuò)增出條帶，由此可知，DNA模板濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較小，根據(jù)條帶的模糊和缺失與否，最終選用30 ng作為適宜的模板濃度。

注：M.DL2000；1～5.模板DNA濃度分別為10、20、30、40、50 ng。 圖1　不同模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR的影響

2.2dNTPs用量對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響由圖2可知，在20 μl反應(yīng)體系中，dNTPs濃度為0.4 mmol/L時(shí)，條帶最為清晰，因此選用0.4 mmoI/L作為適宜的dNTPs濃度。

注：M.DL2000；1～5.dNTPs濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L。 圖2　不同dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR的影響

2.3引物濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增結(jié)果的影響由圖3可知，引物濃度在0.2～0.5 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增效率高，譜帶比較全面。綜合考慮，最終選用0.4 μmol/L為適宜的引物濃度。

注：M.DL2000；1～5.引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L。 圖3　引物濃度對(duì)1SSR-PCR的影響

2.4TagDNA聚合酶劑量對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響由圖4可知，TagDNA酶用量在0.75～1.25 U時(shí)均可以得到重復(fù)清晰的條帶，且無(wú)特異性擴(kuò)增。從經(jīng)濟(jì)適用的角度考慮，確定1.0 U/20 μl為適宜TagDNA聚合酶濃度。

2.5甘西鼠尾草ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)結(jié)果由圖5可知，在9個(gè)處理中，第4號(hào)處理擴(kuò)增效果最好，譜帶強(qiáng)，多態(tài)性高。因此甘西鼠尾草最佳ISSR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系10×Buffer 2 μl，DNA模板為30 ng，Primer為0.3 μmol/L，TagDNA聚合酶為1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足20 μl。

注：M.DL2000；1～5.TagDNA濃度分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 U。 圖4　TagDNA酶對(duì)1SSR-PCR的影響

注：M.DL2000。 圖5　正交設(shè)計(jì)1SSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增

3討論

ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響因素較多，該試驗(yàn)在前期進(jìn)行了大量的預(yù)試驗(yàn)工作，因此在反應(yīng)條件的摸索上較為順利，最終確定適用于甘西鼠尾草20 μl ISSR-PCR體系中各因素的最佳濃度：10×Buffer(Mg2+)2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。此外，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)同一樣品使用不同廠家的Tag酶，PCR擴(kuò)增效果會(huì)有較明顯的區(qū)別。DNA模板的質(zhì)量也直接影響試驗(yàn)結(jié)果，在試驗(yàn)前應(yīng)充分保證DNA模板的純度。

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