高夫超 韓秀萍

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，牡丹江157041）

海南中蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性研究

高夫超 韓秀萍

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，牡丹江157041）

本研究利用微衛(wèi)星DNA方法對(duì)海南中蜂蜜蜂群體多態(tài)性進(jìn)行研究，評(píng)估品種內(nèi)的遺傳變異。結(jié)果共檢測(cè)到55個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為11，單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從8到13不等。所有位點(diǎn)的平均PIC值與平均期望雜合度分別為0.7569(0.0330)與0.8577(0.0267)。表明海南中蜂群體具有較高的多態(tài)性,顯示出豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力，可為分析遺傳多樣性提供充分的信息。

海南中蜂；微衛(wèi)星DNA；遺傳多樣性

海南中蜂(Apis cerana hainana)具有可利用零星蜜源植物，采蜜期長(zhǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)，抗巢蟲(chóng)能力強(qiáng)，消耗飼料少及溫馴性中等優(yōu)點(diǎn)。它是海南獨(dú)有的中華蜜蜂種質(zhì)資源，是以熱帶雨林為主的森林群落及傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的主要傳粉昆蟲(chóng)[1]。海南中蜂在其與生態(tài)環(huán)境長(zhǎng)期對(duì)抗適應(yīng)中獲得了獨(dú)特的遺傳基因，這種獨(dú)特遺傳基因在新品種選育中是必不可少的。但隨著廣東和廣西的大陸中蜂大量的人為遷入，海南中蜂種質(zhì)資源因遺傳結(jié)構(gòu)的改變已難以存在，搶救海南中蜂刻不容緩。海南中蜂遺傳資源的保護(hù)已成為當(dāng)務(wù)之急，保護(hù)海南中蜂也就是保護(hù)蜜蜂遺傳基因的多樣性[2]。

微衛(wèi)星DNA序列是一種簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)DNA序列。其重復(fù)單位為1～6個(gè)核苷酸，由10～50個(gè)重復(fù)單位串聯(lián)組成，在整個(gè)基因組中分布廣且密度高，具有分布廣、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)[3]。微衛(wèi)星標(biāo)記在構(gòu)建蜜蜂遺傳連鎖圖譜、評(píng)價(jià)遺傳多樣性和群體進(jìn)化、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)以及基因定位等研究顯示出很強(qiáng)優(yōu)越性和應(yīng)用性[4]。利用13對(duì)微衛(wèi)星引物從DNA水平上分析海南中華蜜蜂群體內(nèi)的遺傳變異，評(píng)估其群體遺傳結(jié)構(gòu)，為保護(hù)中華蜜蜂種質(zhì)資源和遺傳多樣性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采集了海南省?？谑小傊惺械鹊貐^(qū)中華蜜蜂群體，采集群數(shù)為30群，每群采集成年工蜂數(shù)為10只，并用無(wú)水乙醇溶液浸泡保存。

13對(duì)微衛(wèi)星引物信息列于表1，由上海生工生物公司合成，引物序列參考NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)等網(wǎng)站報(bào)道。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提?。翰捎贸Ｒ?guī)的苯酚/氯仿抽提法提取[5]，加TE溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增條件及程序20μl反應(yīng)體系：模板DNA（50ng/μl）1μl；10×buffer緩沖液為1.8μl；dNTP(10mmol/ L)1.5μl；Mg2+(25mmol/L)1.6～2.0μl；上游引物1.0μl；下游引物1.0μl；Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl；dd H2O11.5～11.9μl。

程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45s，54～59℃退火35s，72℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min；4℃保存。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物多態(tài)性檢測(cè)：1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有擴(kuò)增產(chǎn)物，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性，銀染顯色[6]。利用K成像系統(tǒng)計(jì)算分子量大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 等位基因頻率等位基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬?duì)比率。計(jì)算公式如下：

式中：P i為等位基因的頻率；i為某一微衛(wèi)星位點(diǎn)上的第i個(gè)等位基因；j1j2…jn為與i共顯性的第1到第n個(gè)等位基因；n為該微衛(wèi)星位點(diǎn)上等位基因數(shù)目。1.3.2雜合度(Heterozygosity,H)公式如下：

其中qi為第i個(gè)等位基因基因頻率；n為等位基因數(shù)。

1.3.3 多態(tài)信息含量(Plolymorphic Informa

tion Content,PIC)Bostein等（1980）提出，最初用于連鎖分析時(shí)對(duì)標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì)，現(xiàn)常用來(lái)表示微衛(wèi)星多態(tài)性高低的程度。

其中qi、qj分別為第i和第j個(gè)等位基因基因頻率；n為等位基因數(shù)。

圖1 W4位點(diǎn)部分PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

圖2 H4位點(diǎn)部分PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

表1 13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜蜂微衛(wèi)星DNA檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)用13對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異的擴(kuò)增產(chǎn)物12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀染法顯影、定影。根據(jù)不同基于片段電泳遷移率的不同，利用凝膠成像系統(tǒng)計(jì)算其分子量。部分微衛(wèi)星引物PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜分別見(jiàn)圖1、2。

2.2 群體內(nèi)的遺傳變異

通過(guò)對(duì)海南中蜂群體的13個(gè)微衛(wèi)星座位的PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)了92個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)7個(gè)等位基因，表明所選擇微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳信息比較豐富。其中W3座位有14個(gè)等位基因，H1座位有10個(gè)等位基因。在W6座位存在9個(gè)等位基因，在W5座位存在8個(gè)等位基因，在W4和H2座位存在7個(gè)等位基因。在W2，H3，H5座位存在6個(gè)等位基因。在W1，H4，W7座位存在5個(gè)等位基因。在H6座位僅存在4個(gè)等位基因。所有位點(diǎn)的平均期望雜合度為0.7431，平均觀察雜合度為0.4077，平均多態(tài)信息含量為0.7085，顯示較高的雜合度與豐富的多態(tài)信息含量。

表2 13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因數(shù)、等位基因大小、平均期望雜合度、多態(tài)信息含量

3 討論

3.1 樣本量

微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性越高，等位基因數(shù)目就越多，其基因豐富度等多樣性指標(biāo)的值就越高，有研究結(jié)果表明，樣本量越大，所能觀測(cè)到的每個(gè)位點(diǎn)的基因數(shù)、平均等位基因數(shù)就會(huì)越高，基因豐富度也越大，與這些指標(biāo)的正相關(guān)性很顯著，而與期望雜合度沒(méi)有顯著地相關(guān)性。樣本大小與所觀測(cè)到的每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)、平均等位基因數(shù)及基因豐富度指數(shù)均呈顯著正相關(guān)[7,8]，而與期望雜合度無(wú)顯著相關(guān)；微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的高低直接影響所觀測(cè)到的種群基因豐富度及其檢測(cè)所需的樣本量，對(duì)大多數(shù)種群遺傳和分子生態(tài)學(xué)研究而言，30～50個(gè)個(gè)體是微衛(wèi)星DNA分析所需要的最小樣本量。本研究中在海南中蜂所取的樣本量達(dá)到30個(gè)，已基本能滿足研究需要。

3.2 群體內(nèi)的遺傳變異

本研究中13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)是從已公布的西方蜜蜂標(biāo)記中篩選出來(lái)的，分布于多條染色體或連鎖群中，所給的數(shù)據(jù)具有一定的代表性和可比性。多態(tài)信息含量（PIC）作為衡量基因片段多態(tài)性較好的指標(biāo)，PIC＜0.25時(shí),為低度多態(tài)性位點(diǎn);0,25＜PIC＜0.5時(shí),為中度多態(tài)性位點(diǎn);當(dāng)PIC＞0.5時(shí),該位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)。多態(tài)信息含量關(guān)系到該位點(diǎn)使用效率及可用性，PIC越大，在一個(gè)群體中，該位點(diǎn)的雜合子比例就越大，提供的遺傳信息就越豐富。本研究中所有13個(gè)位點(diǎn)均處于高度多態(tài)性位點(diǎn)，即所有位點(diǎn)平均PIC＞0.5,說(shuō)明所選的13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記能為分析遺傳多樣性提供可信度較高的信息。

等位基因數(shù)是反映群體遺傳變異的一個(gè)重要指標(biāo)，受樣本量影響。本研究的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，平均等位基因數(shù)為7，這一方面說(shuō)明本研究的樣本量比較充分，另一方面進(jìn)一步說(shuō)明這13個(gè)微衛(wèi)星引物在海南中蜂群體中基因頻率分布比較均勻且提供的多態(tài)信息含量比較豐富，用其分析遺傳多樣性具有較高的可靠性和有效性。

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Study on Microsatellite DNA Genetic Diversity of Apis cerana hainana

Gao FuchaoHan Xiuping
(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Mudanjiang 157041)

The research was aiming at studying the populations of Apis cerana hainana by the methods of microsatellite DNA polymorphism.,The result showed that 55 alleles were found in 13 microstaellite loci.The mean number of effective alleles was 11 and the number of alleles per locus ranged from 8 to 13.The average PIC and expected heterozygosity(He)of all loci were 0.7569(0.0330)and 0.8577(0.0267),respectively.These results indicated high polymorphism in therpopulation of Apis cerana hainana,suggesting heterozygosity and high choice potential,thus provide sufficient imformation for analysis of genetic diversity.

Apis cerana hainana;microsatellite DNA;genetic diversity

國(guó)家現(xiàn)代蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-45-SYZ5)。

高夫超，男，副研究員，主要從事蜜蜂學(xué)研究，E-mail:mdjgfc@126.com