蝙蝠TRAIL基因的克隆·表達(dá)及生物學(xué)功能分析

裴麗麗1，2，侯歡歡1，盧 佳1，閆偉莉1，任文華1*

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇連云港 222000)

摘要[目的]克隆蝙蝠TRAIL基因，構(gòu)建蝙蝠可溶性TRAIL原核表達(dá)栽體，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。[方法]通過RT-PCR技術(shù)克隆蝙蝠TRAIL的全長(zhǎng)cDNA序列，實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定其組織分布，將其可溶性片段與表達(dá)載體pET43.1a連接，并在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)和純化，通過western blotting證實(shí)。體外，通過MTT、TrypanBlue和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)純化的可溶性TRAIL蛋白能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。[結(jié)果]成功克隆蝙蝠TRAIL基因，構(gòu)建了重組表達(dá)載體，獲得可溶性TRAIL蛋白。體外試驗(yàn)證明，可溶性蝙蝠TRAIL蛋白能夠誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的凋亡。 [結(jié)論]可溶性蝙蝠TRAIL蛋白可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，該研究為蝙蝠免疫系統(tǒng)的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞TRAIL；蝙蝠；熒光實(shí)時(shí)定量PCR；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)S188

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)

作者簡(jiǎn)介裴麗麗(1987- )，女，山東臨沂人，助教，碩士，從事生物大分子活性物質(zhì)研究。*

收稿日期2015-06-09

The Cloning, Expression and Biological Function of the Bat TRAIL Gene

PEI Li-li1,2, HOU Huan-huan1, LU Jia1, REN Wen-hua1*et al(1. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210046; 2. Kangda College of Nanjing Medical University, Lianyungang, Jiangsu 222000)

Abstract[Objective] To clone gene of the bat TRAIL and construct its soluble prokaryotie expression vector, and investigate its effect on tumor cell apoptosis. [Method] The full-length cDNA of TRAIL from the bat was cloned using RT-PCR techniques. Using real-time PCR to identify its tissue distribution, and its soluble TRAIL gene was linked with pET43.1a, efficiently expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and confirmed by Western blot analysis. In vitro, the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide (MTT) assay, TrypanBlue and Flow Cytometry analysis the purified soluble TRAIL could induce the apoptosis of tumor cells or not. [Result] The bTRAIL was successfully constructed and obtained a soluble bTRAIL protein. In vitro, the soluble bTRAIL could induce the apoptosis of Jurkat and HeLa cells. [Conclusion] The purified soluble bTRAIL protein can induce the apoptosis of the tumor cells. These results about bTRAIL gene would provide a basis for understanding the characteristics of the immune system of the bat.

Key wordsTRAIL;Pipistrellusjavanicus; Real-time PCR; Apoptosis

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子TNF超家族成員之一，通過2個(gè)不同的受體(TRAIL-R1，TRAIL-R2)，啟動(dòng)不同的細(xì)胞效應(yīng)，包括細(xì)胞的存活、活化、增殖、分化和細(xì)胞死亡[1-2]。它還可以在感染部位和有害的全身效應(yīng)部位導(dǎo)致局部組織損傷[3]。在哺乳動(dòng)物中，腫瘤壞死因子超家族成員主要包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、Fas配體(CD95配體)和腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Apo2L/TRAIL)[4-6]。TRIAL廣泛表達(dá)于許多組織中，包括外周血淋巴細(xì)胞、脾、前列腺、卵巢、小腸、大腸、胎盤、肺、肝和腎等，但在正常人腦組織、肝細(xì)胞和睪丸組織中未見表達(dá)。TRAIL能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞等凋亡，而對(duì)正常組織無影響。表明TRAIL具有潛在的癌癥治療作用[7-8]。

關(guān)于蝙蝠和病毒的大多數(shù)知識(shí)都是由狂犬病病毒的研究獲得的[9]。然而，近年來，在醫(yī)學(xué)上，人類和獸類的許多新病毒已被發(fā)現(xiàn)寄生在蝙蝠中。目前，已經(jīng)有超過100個(gè)病毒被檢測(cè)到寄生于蝙蝠。這些病毒在人類和其他物種均能引起疾病，但在自然或試驗(yàn)感染蝙蝠后不會(huì)引起蝙蝠產(chǎn)生疾病[10-12]。說明蝙蝠可能具有自己獨(dú)特的免疫機(jī)制。目前，關(guān)于蝙蝠的研究主要集中在生態(tài)和生理方面，而關(guān)于蝙蝠免疫系統(tǒng)的研究很少[13-14]。筆者克隆的蝙蝠TRAIL基因是第一個(gè)被克隆的翼手目哺乳動(dòng)物TRAIL基因，TRAIL基因的克隆、表達(dá)及功能研究有助于探索翼手目哺乳動(dòng)物的免疫機(jī)制，為闡明蝙蝠免疫系統(tǒng)的特點(diǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和宿主菌。蝙蝠是從南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物所楊光教授實(shí)驗(yàn)室獲得。大腸桿菌E.coli、Top10、BL21和pET43.1a由南京師范大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.2試劑。動(dòng)物組織RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)；PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成試劑盒、pMD19-T載體試劑盒、TaqDNA聚合酶、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒、蛋白Marker、熒光定量PCR試劑盒、rTaq酶、限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自TaKaRa公司；鼠His6一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購(gòu)自TIANGEN公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(R&D Systems Inc.，USA)；所有引物合成及測(cè)序由上海英俊公司完成。

1.2方法

1.2.1蝙蝠脾臟總RNA的提取。利用動(dòng)物組織RNA提取試劑盒，按照說明書操作，提取蝙蝠脾臟細(xì)胞的總RNA。

1.2.2蝙蝠TRAIL(bTRAIL)基因的克隆。通過序列比對(duì)分析已知的人、狗、馬和鼠TRAIL cDNA序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：正義引物bTRAIL F1：5′-ATAATGGCCCCAGAGAAGTCCAG-3′；反義引物bTRAIL F2：5′-CTAGCCAATTAAAAAGGCCCCAA-3′。 用上述引物進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃延伸30 s，72 ℃退火1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。按Axygene公司的DNA膠回收試劑盒操作進(jìn)行割膠回收約843 bp的DNA片段。用clastalW軟件對(duì)蝙蝠TRAIL序列和其他已知物種TRAIL序列進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.3Real-time qPCR檢測(cè)TRAIL的組織分布。解剖蝙蝠，提取蝙蝠脾、心、肝、腎、肺、腸等組織的總RNA，用Primer 3 Input 軟件設(shè)計(jì)蝙蝠TRAIL和內(nèi)參GAPDH引物如下：bTRAIL引物：btTRAILF1：5′- CCCTGCTGGCAAGTAAAGTG-3′；btTRAILF2：5′- CATGCCCTGAGTTTTCCCTG-3′。GAPDH引物：btGAPDH1：5′- GAGCTGAATGGGAAGCTCAC-3′；btGAPDH2：5′- GGAGGAGTGGGTGTCACTGT-3′。Real-time PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 15 s；62 ℃ 20 s；72 ℃ 15 s)。分別取3 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以2﹪的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性條帶。

1.2.4融合表達(dá)載體pET43.1a-bsTRAIL的構(gòu)建。據(jù)bTRAIL的胞外可溶片段設(shè)計(jì)一對(duì)含有pET43.1a酶切位點(diǎn)的基因特異性引物，擴(kuò)增可溶性蝙蝠TRAIL片段(命名為bsTRAIL)，引物如下：bsTRAILF1：CCGGAATTCACCAGTGAGATGCAGCAGATGCA(EocRI site)；bsTRAILF2：CCGCTCGAGGCCAATTAAAAAGGCCCCAA(XhoI site)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，35循環(huán)(94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)，72 ℃ 7 min。純化回收PCR產(chǎn)物。EcoRI、XhoI雙酶切PCR產(chǎn)物與pET43.1a載體進(jìn)行連接，構(gòu)建pET43.1a-bsTRAIL表達(dá)載體。

1.2.5空載體pET43.1a標(biāo)簽蛋白及重組蛋白的體外表達(dá)及鑒定。 首先分別將pET43.1a標(biāo)簽(即Nus-His標(biāo)簽蛋白)及測(cè)序正確的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，分別選取含pET43.1a標(biāo)簽及重組體的表達(dá)菌株，置于LB培養(yǎng)基中(加入Amp+)，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，16 ℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，分別誘導(dǎo)pET43.1a標(biāo)簽蛋白及pET43.1a-bsTRAIL蛋白的表達(dá)。超聲破碎分離上清和沉淀，用鎳柱親和層析法分別獲得pET43.1a標(biāo)簽蛋白及可溶性的pET43.1a-bsTRAIL蛋白，用SDS-PAGE跑膠鑒定，然后用1× PBS(pH8.0)對(duì)目的蛋白液進(jìn)行透析。經(jīng)western blotting鑒定純化的目的蛋白。將pET43.1a標(biāo)簽蛋白及可溶性的pET43.1a-bsTRAIL蛋白的濃度(經(jīng)測(cè)定獲得pET43.1a標(biāo)簽蛋白濃度為1.233 mg/ml；獲得pET43.1a-bsTRAIL蛋白濃度為1.015 mg/ml)按以下公式換算成μmol/L=目的蛋白濃度 / 目的蛋白的分子量(pET43.1a標(biāo)簽蛋白的分子量為66 kD；pET43.1a-bsTRAIL蛋白的分子量為97 kD)。

1.2.6pET43.1a-bsTRAIL蛋白生物活性測(cè)定。采用MTT法、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法、臺(tái)盼藍(lán)染色法及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)已獲得的純化重組pET43.1a-bsTRAIL(命名為重組bsTRAIL)蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)，并以pET43.1a蛋白作為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1bTRAIL的組織特異性分布用實(shí)時(shí)熒光定量PCR以GAPDH作為內(nèi)參[15]分析bTRAIL的mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明bTRAIL的mRNA在心、肝、脾、肺、腎、小腸均有表達(dá)。但mRNA水平在不同組織中表達(dá)有差異(圖2)。其中在脾臟中mRNA表達(dá)量最高，其次是肝臟、腎臟、小腸、心臟，表達(dá)量最低的是肺。這表明蝙蝠TRAIL在免疫系統(tǒng)中起重要作用。

2.2pET43.1a-bsTRAIL蛋白的表達(dá)和純化為檢測(cè)重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白的生物學(xué)活性，重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白表達(dá)于大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)(圖2)顯示，在約97 kD處為目的蛋白，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)24 h達(dá)到最大表達(dá)量。經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，收集的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，以抗His標(biāo)簽為標(biāo)記的western blotting鑒定顯示，純化后的pET43.1a標(biāo)簽蛋白及pET43.1a-bsTRAIL蛋白能與抗鼠His單抗發(fā)生特異性反應(yīng)。經(jīng)測(cè)定獲得pET43.1a標(biāo)簽蛋白濃度為1.233 mg/ml；pET43.1a-bsTRAIL蛋白濃度為1.015 mg/ml。

2.3MTT法檢測(cè)重組bsTRAILMTT法測(cè)定重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白對(duì)Jurkat與HeLa腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用。由圖3可知，在不同濃度下，重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的作用，這種作用呈劑量依賴性，pET43.1a蛋白作為陰性對(duì)照。

2.4Jurkat和HeLa細(xì)胞的形態(tài)觀察和臺(tái)盼藍(lán)染色用4和6 μmol/L重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白分別對(duì)Jurkat和HeLa細(xì)胞處理24、48 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察pET43.1a-bsTRAIL蛋白對(duì)Jurkat和HeLa細(xì)胞作用并進(jìn)行拍照以及經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后拍攝的照片(圖4)。由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)以及濃度的增加，細(xì)胞發(fā)生明顯的破裂和死亡。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡pET43.1a標(biāo)簽蛋白與重組bsTRAIL蛋白對(duì)Jurkat腫瘤細(xì)胞作用36 h后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果見圖5。由圖5可知，4 μmol/L的pET43.1a標(biāo)簽蛋白對(duì)Jurkat細(xì)胞作用后，在凋亡區(qū)FITC(+)/PI(一)檢測(cè)到少量細(xì)胞(0.6%)；4 μmol/L的重組bsTRAIL對(duì)Jurkat細(xì)胞作用后，在早起凋亡區(qū)FITC(+)/PI(一)檢測(cè)到較多細(xì)胞(29.98%)，在晚期凋亡區(qū)FITC(+)/PI(+)檢測(cè)到較少細(xì)胞(11.80%)；6 μmol/L的重組bsTRAIL對(duì)Jurkat細(xì)胞作用后，在晚期凋亡區(qū)FITC(+)/PI(+)檢測(cè)到較多的細(xì)胞(83.41%)。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)成功從蝙蝠脾臟中克隆得到腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的cDNA序列，據(jù)知，目前這是通過分子克隆從翼手目哺乳動(dòng)物中得到的第一個(gè)TRAIL基因。蝙蝠TRAIL(bTRAIL)CDS序列大小為843 bp，編碼280個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KF151168。預(yù)測(cè)蛋白的分子量為32.28 kD，等電點(diǎn)為8.11。和其他TRAIL一樣，蝙蝠TRAIL具有典型的跨膜區(qū)和TNF結(jié)構(gòu)域，具有N端非保守區(qū)，而C端不同物種之間具有較大的保守性。人TRAIL(hTRAIL)蛋白的Cys230通過形成分子間二硫鍵誘導(dǎo)凋亡，是TRAIL發(fā)揮重要功能所必須的，而bTRAIL也具有Cys230。bTRAIL蛋白也含有一個(gè)預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)和一個(gè)保守的半胱氨酸殘基。在氨基酸水平上，用CLUSTAL軟件分析，顯示蝙蝠TRAIL和馬、人、狗和牛之間的序列同源性為68%、67%、68%和63%。這表明，在哺乳動(dòng)物中，TRAIL的氨基酸序列是比較保守的，且胞外區(qū)比胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)更保守。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，TRAIL在蝙蝠脾臟中的表達(dá)量最高，這與在人中TRAIL的分布一致。研究表明[16]，人的不可溶性TRAIL蛋白(sTRAIL)在100 ng/ml(相當(dāng)于3 μmol/L的sTRAIL)處理Jurkat 和 HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞死亡率為43%和45%，明顯大于蝙蝠可溶性TRAIL蛋白對(duì)Jurkat 和HeLa細(xì)胞的作用。此差異，可能是因?yàn)轵鹂扇苄訲RAIL基因和人的sTRAIL對(duì)人TRAIL受體具有不同的結(jié)合親和力。

為了研究重組bsTRAIL的活性，將其構(gòu)建入pET43.1a表達(dá)載體。研究表明，人sTRAIL能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此預(yù)測(cè)重組bsTRAIL也能誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞凋亡，因此采用人Jurkat和Hela細(xì)胞來鑒定重組bsTRAIL的活性。首先采用MTT法檢測(cè)其對(duì)Jurkat和Hela細(xì)胞劑量依賴性的細(xì)胞毒理作用，結(jié)果表明重組bsTRAIL能以劑量依賴性的方式抑制細(xì)胞增殖。此外，重組bsTRAIL處理后，Jurkat和HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察以及臺(tái)盼藍(lán)染色后的形態(tài)學(xué)觀察表明重組bsTRAIL蛋白可以以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)Jurkat和HeLa細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證重組bsTRAIL的細(xì)胞毒理效用，采用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了重組bsTRAIL能夠誘導(dǎo)Jurkat和HeLa細(xì)胞的凋亡。由以上結(jié)果可知，重組bsTRAIL可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的凋亡。但是否重組的bsTRAIL可誘發(fā)其他人類腫瘤細(xì)胞株的凋亡還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，該試驗(yàn)首次從翼手目哺乳動(dòng)物中克隆了蝙蝠TRAIL基因，并得到其活性蛋白，結(jié)果表明重組bsTRAIL能夠誘導(dǎo)Jurkat和Hela細(xì)胞的凋亡，這表明由于在進(jìn)化上的保守性，不同物種的TRAIL蛋白之間存在交叉活性。該試驗(yàn)不僅有利于蝙蝠的保護(hù)工作，也為翼手目哺乳動(dòng)物的生物學(xué)功能研究鑒定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] GOETZ F W，PLANAS J V，MACKENZIE S.Tumor necrosis factors[J].Developmental & Comparative Immunology，2004，28(5)：487-497.

[2] WARE C F.Protein therapeutics targeted at the TNF superfamily[J].Advances in Pharmacology(San Diego，Calif.)，2012，66：51-80.

[3] WATERS J P，POBER J S，BRADLEY J R.Tumour necrosis factor in infectious disease[J].The Journal of Pathology，2013，230(2)：132-147.

[4] GRUSS H J，DOWER S K.The TNF ligand superfamily and its relevance for human diseases[J].Cytokines and Molecular Therapy，1995，1(2)：75-105.

3.抓緊技改，強(qiáng)身健體，渡過難關(guān)。面對(duì)低迷經(jīng)濟(jì)，企業(yè)可主動(dòng)出擊，進(jìn)行技術(shù)改造，為參與市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)創(chuàng)造更多有利條件。

[5] PITTI R M，MARSTERS S A，RUPPERT S，et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family[J].Journal of Biological Chemistry，1996，271(22)：12687-12690.

[6] WARE C F.TNF superfamily 2008[J].Cytokine & Growth Factor Reviews，2008，19(3/4)：183.

[7] FOX N L，HUMPHREYS R，LUSTER T A，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)receptor-1 and receptor-2 agonists for cancer therapy[J].Expert Opinion on Biological Therapy，2010，10(1)：1-18.

[8] GERSPACH J，PFIZENMAIER K，WAJANT H.Therapeutic targeting of CD95 and the TRAIL death receptors[J].Recent Patents on Anti-cancer Drug Discovery，2011，6(3)：294-310.

[9] CALISHER C H，CHILDS J E，F(xiàn)IELD H E，et al.Bats：Important reservoir hosts of emerging viruses[J].Clinical Microbiology Reviews，2006，19(3)：531-545.

[10] WONG S，LAU S，WOO P，et al.Bats as a continuing source of emerging infections in humans[J].Reviews in Medical Virology，2007，17(2)：67-91.

[11] MEERBURG B G，SINGLETON G R，KIJLSTRA A.Rodent-borne diseases and their risks for public health[J].Critical Reviews in Microbiology，2009，35(3)：221-270.

[12] CHUA K B，CRAMERI G，HYATT A，et al.A previously unknown reovirus of bat origin is associated with an acute respiratory disease in humans[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104(27)：11424-11429.

[13] WANG L F，SHI Z，ZHANG S，et al.Review of bats and SARS[J].Emerging Infectious Diseases，2006，12(12)：1834.

[14] YOU F，REN W，HOU H，et al.Molecular cloning，expression，bioinformatics analysis and bioactivity characterization of TNF13B(BAFF)gene in bat (VespertiliosuperansThomas)[J].International Immunopharmacology，2012，12(2)：433-440.

[15] SU J G，ZHANGA R F，DONG J，et al.Evaluation of internal control genes for qRT-PCR normalization in tissues and cell culture for antiviral studies of grass carp(Ctenopharyngodon idella)[J].Fish & Shellfish Immunology，2011，30：830-835.

[16] LI J F，AI H X，ZHANG J，et al.Molecular cloning，functional characterization and phylogenetic analysis of TRAIL in Japanese pufferfish Takifugu rubripes[J].Journal of Fish Biology，2011，79(3)：747-760.