不同馴化手段下多氯聯(lián)苯降解菌群落結構差異分析

梁文涓1,閆 勇2

(1.沈陽建筑大學市政與環(huán)境工程學院，遼寧沈陽 110168；2.沈陽建筑大學土木工程學院，遼寧沈陽 110168)

摘要[目的] 研究不同馴化手段下多氯聯(lián)苯降解菌群落結構差異,為多氯聯(lián)苯污染場址的生態(tài)修復提供借鑒。[方法] 應用PCR-DGGE技術對8種馴化手段下的活性污泥進行分析。[結果]加入同一種PCB單品的體系中，生物群落的相似度相對較高；好氧體系之間的相似性較好氧與厭氧體系之間的相似性要高；在好氧條件下，高氯PCB體系較低氯PCB體系中生物相豐富；好氧體系較厭氧體系的生物相豐富；一些物種在好氧體系和厭氧體系中均存在。[結論]該研究有利于多氯聯(lián)苯降解菌庫的充實和完善。

關鍵詞多氯聯(lián)苯；PCR-DGGE；活性污泥；群落結構

中圖分類號S188;X171.4

作者簡介梁文涓(1990-)，女，山西長治人，碩士研究生，研究方向：污染修復生態(tài)學。

收稿日期2015-06-01

Analysis on the Community Structure of PCBs Degrading Bacteria under Different Domestication Means

LIANG Wen-juan1, YAN Yong2(1. School of Municipal and Environmental Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang, Liaoning 110168; 2. School of Civil Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang, Liaoning 110168)

Abstract[Objective] The aim was to analyze the differences of community structure of PCBs degrading bacteria under different means of domestication means, and provide references for the ecological restoration of contaminated sites by polychlorinated biphenyls.[Method] PCR-DGGE technology was used to analyze the activated sludges under 8 kinds of domesticated methods. [Result] To join the same kind of PCB item system, the similarity of biological communities was relatively high; In aerobic system the similarity was higher than between aerobic and anaerobic systems; Under aerobic conditions, biological phase in the high chlorine PCB system was richer than in low chloride PCB system; biological phase in aerobic system was recher than the anaerobic system; Some species was exsited in aerobic system and anaerobic systems. [Conclusion]Some empirical rules were obtained, which was conductive to the enrichment and improvement of the library of PCBs degradation bacteria.

Key words Polychlorinated biphenyls; PCR-DGGE; Activated sludge; Community structure

微生物降解被認為是PCBs在自然界中降解的主要途徑，有關此類的研究相當活躍。近年來在其基礎上發(fā)展起來的應用生物降解原理治理被污染環(huán)境的生物修復技術發(fā)展很快，由于其經濟、安全，能處理的閾值低、殘留少，其應用前景十分廣闊。研究不同馴化手段下多氯聯(lián)苯降解菌群落結構差異可以為多氯聯(lián)苯污染場址的生態(tài)修復提供借鑒。

變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技術是基于核酸序列的不同，將片段大小相同的DNA序列分開[1]。不同序列的DNA片段都有一個或多個溶解區(qū)域，首先在解鏈溫度較低的堿基區(qū)域開始解鏈，即DNA中A∶T堿基區(qū)域首先溶解，而G∶C含量高的區(qū)域仍保持雙鏈。部分溶解的DNA雙鏈最后停留在各自相應的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構型的變化，導致電泳速度急劇下降，最后在其相應的變性劑梯度位置停滯[2]，這種電泳遷移率的差異經過染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。由于DNA分子中G∶C堿基對比A∶T堿基對結合更為牢固，G∶C含量高的區(qū)域需要較高的解鏈溫度。為了提高DGGE對序列差異的分辨率，通常在引物的3′端加上一個“GC夾板”(GC-clamp)，一般含有30～50個堿基，從而形成一個人工高溫解鏈區(qū)，使DNA片段的原有部分由于處在低溫解鏈區(qū)，從而實現(xiàn)更好的分離效果。通過“GC夾板”與PCR技術相結合，運用DGGE技術可檢測PCR擴增DNA片段的多態(tài)性，分辨具有相同或相近分子量目的片段的序列差異，進一步分析活性污泥微生物群落中優(yōu)勢種群以及群落結構多樣性。該技術是目前研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。筆者應用凝膠分析軟件BandScan5.0對DGGE圖譜的條帶進行影像定位和相似性分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進行聚類分析。

1 材料與方法

1.1 活性污泥DNA提取取天津市紀莊子污水處理廠和天津市大沽化工污水處理廠處理過程中的活性污泥。

50 ml培養(yǎng)體系中有10 ml活性污泥混合液，加入不同的PCB單品(表1)，濃度均為5 mg/L，培養(yǎng)基成分同富集培養(yǎng)基。

按Biospin Bacteria Genomic DNA提取試劑盒的使用說明書對上述預處理后污泥混合液的細菌DNA進行提取，最終得到100 μl DNA溶液置于-20 ℃冷凍保存。對編號1～8活性污泥體系的DNA逐一進行提取。

表1　 DNA提取體系

注：1～6為好氧降解體系，7和8為厭氧降解體系。

提取出的DNA溶液在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，電泳條件：電壓120 V，上樣液為6×Loading Buffer，上樣比例為DNA溶液10 μl+6×Loading Buffer 2 μl，每個DNA提取體系設2個上樣點，每個泳道上樣量為20 μl，Marker為λ Hind III，電泳時間為50 min。

1.2 PCR擴增將提取的基因組DNA作為模板進行PCR擴增。擴增引物1為帶有一“GC夾”[3](5′-CGCCCGCCGCGCGGCGGCGGGCGGGGCGGCACGGGGGG-3′)的357F(5′-GC clamp-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)；擴增引物2為518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，擴增產物片段長約為600 bp[4]，引物濃度調節(jié)到0.1～1.0 μmol/L。

（3）項目直接負責的單位領導層，沒有基本的責任意識，再者缺乏專業(yè)的項目指導，也沒有專業(yè)的技術支持團隊，因此很難保證工程的質量。一般存在于項目前期階段不完整，施工中形成的更多的矛盾，使施工方疲于應付各種局部的矛盾，削弱了能源管理的質量。，總而言之，巧婦難為無米之炊，專業(yè)設備投資力度不夠，技術水平不到位，再加上沒有資深的專業(yè)技術人員和施工團隊，也沒有核心的管理的網系關系，施工團隊組織渙散，好像打仗的軍隊潰不成軍，如何能夠保證效率和質量。

50 μl反應體系：1 μl DNA模板，25 μl 2×PCR Master Mix(含有3 mmol MgCl2、0.2 mmol/L的dNTP、0.1 U/μl的TaqDNA聚合酶和2×PCR緩沖液)，2 μl引物1，2 μl引物2，其余用無菌超純水補足50 μl[5]。

PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸2 min。擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。電泳條件：電壓90 V，每個泳道上樣量為15 μl，Marker為λ Hind III ，電泳時間為50 min。PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

1.3.1 PCR產物變性梯度凝膠電泳分析。將總細菌PCR產物用變性梯度凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE。使用梯度混合器制備6%～l2%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度30%～50%。在150 V、60 ℃的條件下電泳6.5 h。電泳完畢后，將凝膠進行硝酸銀染色。

1.3.2 DGGE圖譜分析。應用凝膠圖像分析軟件BandScan5.0對掃描所得的DGGE圖譜進行條帶分析，獲取條帶的數字化信息，然后用NTSYS-PC軟件計算材料間的Dice遺傳相似系數進行相似度分析，按不加權成對算術平均法(UPGMA)建立系統(tǒng)聚類分支樹狀圖進行聚類分析，評價樣品微生物群落結構。

2 結果與分析

2.1 PCR產物電泳結果將PCR產物取樣15 μl進行變性梯度凝膠電泳，結果見圖1。

2.2 變性梯度凝膠電泳分離擴增結果將8個馴化體系所得的16S rRNA片段通過變性梯度凝膠電泳。應用凝膠分析軟件BandScan對掃描所得的DGGE圖譜進行條帶分析，獲取條帶的數字化信息。由圖2可知，分離得到一系列條帶，根據條帶對比的結果，根據戴斯系數(Dice coefficient)計算出各樣品相似性矩陣(表2)，最大相似度為0.806(體系5和體系6)，最小相似度為0.627(體系2和體系4)。相似性高說明體系中生物群落相似性越高；相似性低說明微生物群落多樣化。

由圖3可知，1～6好氧體系中，來自大沽化工廠活性污泥的體系條帶個數明顯多于紀莊子污水處理廠。天津大沽化工廠以食鹽電解為基礎，另外還生產燒堿、聚氯乙烯樹脂、環(huán)氧丙烷、聚醚、液體氯、合成鹽酸等產品，是一家綜合性大型氯堿企業(yè)，該廠廢水的含氯有機物種類繁多，造成了活性污泥中特殊的微生物群落。因此，大沽化工廠的污泥中適應PCBs的微生物相明顯比處理生活污水的紀莊子污水處理廠污泥的微生物相豐富。該研究中厭氧體系只有2個，可以作為對照。

在四氯代的體系中(體系3、4、7、8)，好氧條件下，大沽化工廠的污泥體系(體系4)可利用PCBs的微生物比紀莊子的污泥體系(體系3)豐富；而厭氧條件下，紀莊子的污泥體系(體系4)可利用PCBs的微生物比大沽化工廠的污泥體系(體系3)豐富。

從氯取代的個數來看，可利用四氯代的PCBs微生物可能比可利用二氯聯(lián)苯、五氯聯(lián)苯的種類更多。

表2　 8個馴化體系微生物群落結構的相似性矩陣

由圖2可知，每個樣品各分離出不同位置的電泳條帶，各條帶的形成是基于PCR產物產量和遷移率的不同，因此可以表征污泥樣品中優(yōu)勢菌群的分布[6]。根據DGGE對不同DNA片段的分離原理，可以得知樣品的PCR產物中既含有相同的DNA片斷，也含有多種不同的DNA片斷。從原理上，每一個片斷可以代表一個微生物種屬，條帶信號越強，該種屬在污泥中具有越明顯的優(yōu)勢地位。

2.3 聚類分析通過NTSYS-PC軟件對DGGE指紋圖譜進行UPGMA聚類分析(圖4)。當相似度為0.72時，8個體系可聚為3類。

類I包含2個體系，分別是：添加二氯聯(lián)苯(2,2′-二氯聯(lián)苯)和紀莊子污水處理廠活性污泥的好氧體系(編號1)、添加二氯聯(lián)苯(2,2′-二氯聯(lián)苯)和大沽化工廠活性污泥的好氧體系(編號2)。兩者均為好氧培養(yǎng)條件下添加二氯聯(lián)苯(2,2′-二氯聯(lián)苯)的體系。

類II有5個體系，分別是：添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的紀莊子污水處理廠的好氧體系(編號3)、添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的大沽化工廠活性污泥的好氧體系(編號4)、添加五氯聯(lián)苯(2,2′,3,4,5-五氯聯(lián)苯)的紀莊子污水處理廠活性污泥的好氧體系(編號5)、添加五氯聯(lián)苯(2,2′,3,4,5-五氯聯(lián)苯)的大沽化工廠活性污泥的好氧體系(編號6)、添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的紀莊子化工廠活性污泥的厭氧體系(編號7)。

類III只有一個體系：添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的大沽化工廠活性污泥的厭氧體系(編號8)。

3 結論與討論

該研究總體呈現(xiàn)如下規(guī)律：①加入同一種多氯聯(lián)苯單品的體系中，生物群落的相似度相對較高；②好氧體系之間的相似性較好氧與厭氧體系之間的相似性要高；③在好氧條件下，高氯PCB體系較低氯PCB體系中生物相豐富；④好氧體系較厭氧體系的生物相豐富；⑤一些物種在好氧體系和厭氧體系中均存在。

采用不同馴化手段分析了多氯聯(lián)苯降解菌群落結構差異性，該研究主要從好氧、厭氧，以及加入不同的多氯聯(lián)苯單品形成不同的馴化環(huán)境，對多氯聯(lián)苯降解菌進行定向馴化。通過NTSYS-PC軟件對DGGE指紋圖譜進行UPGMA聚類分析，可以了解多氯聯(lián)苯降解菌群落結構差異性以及相關性，得出一些經驗性的規(guī)律，有利于多氯聯(lián)苯降解菌庫的充實和完善。

參考文獻

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