劉笑，侯順超，顧林

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州，225000)

胡椒(Piper nigrum L)，又名白川、浮椒，是胡椒科胡椒屬常綠藤本植物［1］。原產(chǎn)于印度，被稱為“熱帶香料之王”，西漢時期傳入我國，如今已成為我國海南的特色產(chǎn)業(yè)［2］。根據(jù)果實的成熟程度胡椒有黑白之分，白胡椒粒圓個大，質(zhì)堅味強，呈(灰)白色，手感質(zhì)地略重，氣味不及黑胡椒辛辣［3-4］。雖然白胡椒中揮發(fā)油含量及所含的化學成分低于黑胡椒，但在藥用價值和臨床應用方面，以白胡椒作用較佳［5］，尤其是驅(qū)寒除濕、健胃保肝的功效更為顯著。胡椒堿是胡椒中主要的生物活性物質(zhì)，近年來倍受關(guān)注，成為保健產(chǎn)品開發(fā)的新資源。胡椒堿具有抗炎［6］、抑菌［7-8］、降血脂［9］、抗氧化［10］等活性，對白癜風［11］、抑郁癥［12］、心肌缺血［13］等疾病有一定療效，更有潛力被開發(fā)為新的抗癌藥物［14-16］。國內(nèi)外對于胡椒堿提取方法的研究很多，主要有酸水提取法［17］、有機溶劑浸提法［18-19］、超聲波輔助法［20-21］、超臨界流體萃取法［22-23］和微波減壓蒸餾法［24-25］等，但是所得提取液多為胡椒堿粗提液，雜質(zhì)較多，需要進一步純化。

大孔吸附樹脂廣泛用于黃酮類、多酚類、生物堿等活性成分的分離純化［26-28］，具有快速、高效、選擇性強、可再生等優(yōu)點。目前僅有采用HPD 800、H 103大孔樹脂純化胡椒堿的報道［29-30］。本文選用HPD系列5種不同極性的大孔樹脂對白胡椒中胡椒堿提取物進行吸附解析，從中篩選出較為合適的樹脂類型進行胡椒堿的純化工藝研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白胡椒，海南儋州市;胡椒堿標準品(98%)，天津一方科技有限公司;無水乙醇(分析純)，上海蘇懿化學試劑有限公司;HPD系列大孔樹脂，河北滄州寶恩化工有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;HL-2S恒流泵、DBS-100電腦全自動部份收集器，上海青浦滬西儀器廠;紫外分光光度計，上海欣茂儀器有限公司;KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胡椒堿粗提液的制備［31］

稱取適量白胡椒置于50℃烘箱中恒溫干燥48 h，粉碎并過100目篩，得到白胡椒粉備用。將白胡椒粉和無水乙醇按料液比1∶20(g∶mL)加入250 mL錐形瓶中浸泡，暗處靜置1 h，超聲提取后抽濾得到濾液，即為胡椒堿提取液。

1.3.2 標準曲線的制備

準確稱取15 mg胡椒堿標品，無水乙醇定容至100 mL，分別取200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μL于25 mL容量瓶中，無水乙醇定容，得到濃度分別為 1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4 μg/mL 的胡椒堿醇溶液，以無水乙醇作參比，于波長342 nm處測吸光度，繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 胡椒堿吸光度標準曲線Fig.1 piperine absorbance standard curve

稀釋至一定倍數(shù)的提取液于波長342nm處測吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算出胡椒堿質(zhì)量濃度。

1.3.3 靜態(tài)吸附與解析

1.3.3.1 樹脂類型對胡椒堿靜態(tài)吸附-解析的影響

根據(jù)胡椒堿的理化特性和大孔樹脂的吸附性能，選用 HPD 100、HPD 400、HPD 722、HPD 750、HPD 950五種大孔樹脂進行試驗。分別稱取4 g預處理好的樹脂(濕重)置于100 mL錐形瓶中，加入1.94 mg/mL的胡椒堿原液30 mL，常溫下避光吸附12 h，測定吸附后胡椒堿溶液的質(zhì)量濃度。分別向濾出的樹脂中加入30 mL pH 3的無水乙醇，30℃避光解析12 h，測定解析后溶液中胡椒堿質(zhì)量濃度，計算吸附率、解析率和胡椒堿得率。

c0:胡椒堿原液的質(zhì)量濃度，mg/mL;c1:吸附后胡椒堿的質(zhì)量濃度，mg/mL;c2:解析后溶液中胡椒堿的質(zhì)量濃度，mg/mL;m:樹脂質(zhì)量，g;V:原液體積，mL。

1.3.3.2 原液質(zhì)量濃度對胡椒堿靜態(tài)吸附的影響

稱取4 g預處理好的樹脂(濕重)置于100 mL錐形瓶中，分別加入30 mL質(zhì)量濃度為1.5、1.9、2.2、2.6、3.0、3.4、3.8 mg/mL 的胡椒堿原液，常溫下避光吸附5 h，測定吸附后胡椒堿溶液的質(zhì)量濃度，計算吸附率和吸附量。

1.3.3.3 解析液乙醇體積分數(shù)對胡椒堿靜態(tài)解析的影響

預處理好的樹脂(濕重)中加入一定量2.6 mg/mL的胡椒堿原液，常溫下避光吸附5 h，測定吸附后胡椒堿溶液的質(zhì)量濃度。稱取5份4 g濾出的樹脂，分別加入30 mL pH 3體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%、95%、100%的乙醇，30℃避光解析5 h，測定解析后溶液中胡椒堿質(zhì)量濃度，計算解析率。

1.3.4 動態(tài)吸附與解析

1.3.4.1 上柱液流速對胡椒堿動態(tài)吸附的影響

選用Φ1.6 cm ×50 cm的玻璃層析柱，稱取35 g HPD 722大孔樹脂，濕法裝柱，有效柱高約25 cm。調(diào)節(jié)恒流泵，使質(zhì)量濃度為2.6 mg/mL的胡椒堿原液分別以1、3、6 mL/min的流速進樣，每5 mL收集一管，測定試管中胡椒堿濃度，計算吸附率。

1.3.4.2 HPD 722樹脂動態(tài)解析胡椒堿

質(zhì)量濃度為2.6 mg/mL的胡椒堿原液以3 mL/min的流速進樣，HPD 722樹脂充分吸附后，用pH 3的無水乙醇洗脫，每5或10 mL收集一管，測定試管中胡椒堿濃度，計算解析率。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附與解析

2.1.1 樹脂類型對胡椒堿靜態(tài)吸附-解析的影響

由表1可知，HPD系列不同極性的樹脂對胡椒堿的吸附-解析效果不同。試驗中HPD 950的吸附率最高，但解析率很低，故其胡椒堿得率最低;而HPD 722、HPD 100和HPD 750的得率相對較高，這可能是由于胡椒堿屬于弱堿性物質(zhì)，但又有一定的極性和親水性，有利于某些弱極性或非極性樹脂的吸附，故對這3種樹脂作進一步比較，試驗結(jié)果見圖2和圖3。

表1 不同樹脂對胡椒堿靜態(tài)吸附-解析效果的影響Table 1 Adsorption and desorption capabilities of different macroporous resins to piperine

由圖2可知，胡椒堿吸附率隨著吸附時間的延長而增大，當吸附時間超過5 h后，HPD 100和 HPD 722吸附率逐漸達到飽和，分別為52.157%和53.019%，HPD 750的吸附率在吸附3 h后達到最大值43.012%。由圖3可知，1～5h內(nèi)解析率逐漸增加，此后再延長解析時間，解析率幾乎無變化。雖然HPD 750解析率高達82.155%，但其解析率最低，綜合考慮吸附率和解析率2個參數(shù)，本試驗選用HPD 722大孔樹脂對胡椒堿進行純化，且靜態(tài)解析和吸附的時間均采用5 h。

圖2 三種樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.2 Static adsorption kinetic curves of 3 types of macroporous resins

圖3 三種樹脂靜態(tài)解析動力學曲線Fig.3 Static desorption kinetic curves of 3 types of macroporous resins

2.1.2 原液質(zhì)量濃度對胡椒堿靜態(tài)吸附的影響

由圖4可知，樹脂吸附效率隨著胡椒堿原液質(zhì)量濃度的增加而增大，當濃度為2.6 mg/mL時，吸附率達到最大，53.332%。此后再增加濃度，吸附率明顯降低。同樣樹脂的吸附量隨著原液濃度的增加而增大，當濃度超過2.6 mg/mL后，吸附率的增加幅度明顯減小。這可能是因為大孔樹脂吸附為物理吸附，隨著原液質(zhì)量濃度的提高，樹脂吸附的雜質(zhì)量也有所增加，對胡椒堿的吸附量趨于飽和甚至下降，同時還會產(chǎn)生多層吸附，導致樹脂微孔堵塞，降低內(nèi)孔的利用度，導致吸附率降低。綜上所述，試驗選取胡椒堿原液的質(zhì)量濃度為2.6 mg/mL。

圖4 胡椒堿質(zhì)量濃度對靜態(tài)吸附的影響Fig.4 Effect of concentration of piperine on static adsorption

2.1.3 解析液乙醇體積分數(shù)對胡椒堿靜態(tài)解析影響

由圖5可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，胡椒堿的解析率也顯著增加，說明乙醇濃度對解析的影響很大，這可能是因為胡椒堿易溶于乙醇，故試驗選用無水乙醇進行解析。

圖5 乙醇體積分數(shù)對靜態(tài)解析的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on static desorption

2.2 動態(tài)吸附與解析

2.2.1 上柱液流速對胡椒堿動態(tài)吸附的影響

由圖6可知，上柱液流速為6 mL/min時，吸附效率最低，這可能是由于流速過快，樹脂與胡椒堿分子不能充分接觸，胡椒堿直接隨著上柱液流出層析柱，從而損失較大?？紤]到流速過小，吸附時間較長，故選用3 mL/min為上柱液流速。

2.2.2 HPD 722樹脂動態(tài)解析曲線

圖7為HPD 722樹脂動態(tài)解析胡椒堿曲線。由圖7可知，洗脫液中胡椒堿濃度隨著解析液體積的增加而增大，當體積達到50 mL時，胡椒堿含量達到最大值，之后逐漸減少，當體積為200 mL時，洗脫液中胡椒堿含量幾乎為0。故選用洗脫液體積200 mL。

圖7 動態(tài)解析曲線Fig.7 Dynamic desorption curves of piperine

質(zhì)量濃度為2.6 mg/mL的胡椒堿原液以3 mL/min的流速上樣110 mL，HPD 722樹脂充分吸附后，用200 mL、pH 3的無水乙醇進行洗脫，重復3次平行試驗。結(jié)果顯示，吸附率53.059%，解析率69.012%，胡椒堿得率36.617%。

3 結(jié)論

本實驗對HPD系列5種型號的大孔樹脂進行篩選，選用HPD 722大孔樹脂純化胡椒堿。通過考察胡椒堿原液質(zhì)量濃度、解析液乙醇體積分數(shù)及上柱液流速對靜態(tài)和動態(tài)純化效果的影響，初步確定胡椒堿的吸附-解析條件為:上柱液胡椒堿質(zhì)量濃度2.6 mg/mL，流速3 mL/min，上樣體積 110 mL，HPD 722 樹脂充分吸附后，pH 3無水乙醇洗脫，洗脫液體積200 mL。此條件下，吸附率53.059%，解析率69.012%，胡椒堿得率可達36.617%。HPD 722大孔樹脂對胡椒堿有較好的純化效果，選擇性好，效率高，操作簡單且無毒害作用。

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