馬瑞芬，惠文彥，白梅，張文羿，孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

益生菌是指通過攝入適當(dāng)量從而對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活性微生物，其通?？蓙碓从诎l(fā)酵食品、有益共生物和環(huán)境［1］。這些微生物和宿主間的相互作用機(jī)理多種多樣，例如:影響共生菌群的結(jié)構(gòu)組成和功能、改變宿主上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者免疫應(yīng)答［2］。近些年的研究成果顯示，益生菌的攝入在特定條件下可改變特定人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)，包括過敏性皮炎、結(jié)腸炎和腸應(yīng)激綜合征，但一直缺乏有力的支撐證據(jù)［3-5］。

微生物的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化研究(adaptive laboratory evolution，ALE)是在人為因素的作用下通過控制環(huán)境來研究微生物的進(jìn)化。早在1983年，細(xì)菌學(xué)家Russell就列舉了在進(jìn)化生物學(xué)領(lǐng)域研究中細(xì)菌的一些“明顯生長優(yōu)勢”，其中就提出嚴(yán)格控制細(xì)菌生長的變化的環(huán)境，并在適當(dāng)時(shí)間和空間內(nèi)為其更換新鮮培養(yǎng)基來研究細(xì)菌［6］。直到20世紀(jì)末實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化理論才以一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科問世［7］。最初的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化是對(duì)恒化器中適應(yīng)性進(jìn)行準(zhǔn)確測量以揭示自然突變與工程突變之間的微妙變化與聯(lián)系［8］以及代謝與適應(yīng)性間的關(guān)系［9］。之后的研究是長期連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)。伴隨著分子技術(shù)的進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化已經(jīng)延伸到基因水平的研究。通過全基因組序列的測定，可進(jìn)一步揭示進(jìn)化的動(dòng)力學(xué)問題［10］。

Lactobacillus casei Zhang(L.casei Zhang)是從內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族家庭制作的16份酸馬奶樣品中分離得到的1株益生乳桿菌［11］。具有以下特點(diǎn):優(yōu)良的益生特性，包括酸和膽鹽耐受性［12］、降膽固醇、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)以及調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等［13-16］。本文在已有工作基礎(chǔ)之上，檢測了L.casei Zhang在普通MRS培養(yǎng)基中連續(xù)傳代1 000～2 000代期間3個(gè)譜系的進(jìn)化特性變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

益生菌L.casei Zhang培養(yǎng)1 000代后的衍生菌株是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫(LABCC)提供，LABCC編號(hào)IMAU10048。

1.1.2 試劑與儀器

試劑:法國梅里埃合成無糖MRS培養(yǎng)基，紐西蘭超特級(jí)脫脂乳粉，葡萄糖、HCl、NaOH、NaCl、瓊脂粉等常用試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

儀器:潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F型)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱(LRH-500F型)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，5810R 型)，德國;pH 計(jì)(SJ-3F 型)，上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠;超純水系統(tǒng)(MUL-9000，昆山總馨企業(yè)有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(UV-1700 PharmaSpec型，SHIMADZU);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(MLS-3751L型，PANASONIC)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L.casei Zhang連續(xù)傳代培養(yǎng)及培養(yǎng)代數(shù)計(jì)算

將1 000代益生菌L.casei Zhang三株平行菌株L.casei Zhang-1、L.casei Zhang-2、L.casei Zhang-3 按體積分?jǐn)?shù)1%接種量進(jìn)行長期連續(xù)傳代培養(yǎng)至2 000代。在每個(gè)傳代周期(24 h)內(nèi)，菌體菌數(shù)約增長100倍，生長代數(shù)約為6.64 代［17］。

1.2.2 L.casei Zhang細(xì)胞形態(tài)觀察

在菌株L.casei Zhang連續(xù)傳代過程中，培養(yǎng)至2000代時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、油鏡觀察、照相，觀察培養(yǎng)周期末菌株細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 L.casei Zhang培養(yǎng)周期末活菌數(shù)變化

在菌株傳代過程中，每培養(yǎng)200代測定各個(gè)菌株在培養(yǎng)周期末(24 h)的活菌數(shù)。樣品經(jīng)倍比稀釋到合適梯度后，采用MRS固體培養(yǎng)基平皿傾注法，37℃厭氧培養(yǎng)72 h后計(jì)菌落總數(shù)，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為活菌總數(shù)測定的指標(biāo)。

1.2.4 L.casei Zhang培養(yǎng)周期末濁度變化

在菌株傳代過程中，每培養(yǎng)200代測定連續(xù)3天的培養(yǎng)周期末的培養(yǎng)液濁度。傳代培養(yǎng)液用未接菌培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，采用比濁法于600 nm處測定其濁度。

1.2.5 L.casei Zhang產(chǎn)酸活力測定

在菌株傳代過程中，每培養(yǎng)200代測定菌株的產(chǎn)酸活力。各菌株以1×107/mL接種于10 mL滅菌脫脂乳中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，取出后立即放入冰浴，每樣加30 mL蒸餾水稀釋后，以酚酞作指示劑，以0.1 mol/L的NaOH滴定至微紅色30 s不退色為止，記錄消耗NaOH的體積以計(jì)算出樣品中的乳酸濃度，再換算為活力單位。

發(fā)酵活力:以每107個(gè)菌體細(xì)胞在此條件下發(fā)酵1 mL脫脂乳產(chǎn)生1 μg乳酸計(jì)為1個(gè)活力單位(U)［18］。

U=0.1 V×M

式中:U為活力單位;V為消耗NaOH的體積;M為乳酸的摩爾質(zhì)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析;采用Origin8.6繪圖軟件進(jìn)行繪圖。各項(xiàng)指標(biāo)均做3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.casei Zhang細(xì)胞形態(tài)觀察

圖1所示為L.casei Zhang分別在1 000代和2 000代時(shí)顯微鏡照相的照片。由圖1可知，L.casei Zhang 1 000代的3個(gè)譜系的細(xì)胞均為短桿狀、成對(duì)或呈鏈桿狀排列。與1 000代3個(gè)譜系細(xì)胞形態(tài)相比，在MRS培養(yǎng)基中連續(xù)傳代至2 000代，3個(gè)譜系的細(xì)胞形態(tài)與之前相同，細(xì)胞體積也沒有發(fā)生顯著變化。這說明，L.casei Zhang細(xì)胞未發(fā)生明顯的變異情況。當(dāng)然，這一結(jié)論只能作為評(píng)價(jià)該譜系群體進(jìn)化規(guī)律的部分參考，關(guān)于其細(xì)胞內(nèi)部成分組成及其比例是否發(fā)生變化仍然需要更進(jìn)一步的研究。

圖1 L.casei Zhang傳1 000～2 000代期間細(xì)胞形態(tài)對(duì)比Fig.1 Cell appearance of Lactobacillus casei Zhang during subculturing for 1 000～2 000 generations

2.2 L.casei Zhang生長周期末活菌數(shù)

L.casei Zhang在連續(xù)培養(yǎng)1 000～2 000代期間，不同代數(shù)3個(gè)譜系所形成的群體在培養(yǎng)周期末的活菌數(shù)變化情況見圖2。

圖2 L.casei Zhang在不同培養(yǎng)代數(shù)的活菌數(shù)變化Fig.2 Viable counts of L.casei Zhang of different generations

由圖2可以看出，在MRS培養(yǎng)基中，3個(gè)譜系活菌數(shù)在傳代過程中變化不明顯;縱向比較3個(gè)平行培養(yǎng)的菌落發(fā)現(xiàn)，在最初開始培養(yǎng)時(shí)活菌數(shù)就有差異，但這樣的差異并沒有隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而持續(xù)?？傮w來看，L.casei Zhang在傳代1 000～2 000代期間，3個(gè)譜系間活菌數(shù)的進(jìn)化趨勢基本平行，菌株的平均適應(yīng)性也相對(duì)穩(wěn)定。側(cè)面反映了該菌株具有穩(wěn)定的表型特性。

2.3 L.casei Zhang周期末濁度

在連續(xù)培養(yǎng)1 000～2 000代過程中，L.casei Zhang在培養(yǎng)周期末的OD600值變化情況見圖3。由圖3可以看出L.casei Zhang三個(gè)譜系的OD600值在1 400代之前均呈現(xiàn)增長的趨勢，到1 600代時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)又整體下降，之后又有所增加。通過對(duì)比活菌數(shù)發(fā)現(xiàn)菌株在1 600代時(shí)適應(yīng)性與之前相比無明顯差異，因此推斷3個(gè)譜系在連續(xù)進(jìn)化1 000～2 000代期間OD600值產(chǎn)生的不規(guī)律的變化可能是最初接菌時(shí)產(chǎn)生的誤差所致。3個(gè)譜系之間周期末濁度沒有發(fā)生明顯變異.且處于平行進(jìn)化的趨勢。

圖3 L.casei Zhang在不同培養(yǎng)代數(shù)的濁度變化Fig.3 The OD600value of L.casei Zhang of different generations

2.4 L.casei Zhang產(chǎn)酸活力變化

實(shí)驗(yàn)研究了連續(xù)傳代培養(yǎng)1 000～2 000代過程中，每200代測定菌株的產(chǎn)酸活力，測定結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，菌株在1 400代時(shí)3個(gè)譜系的產(chǎn)酸活力均有微小下降，但變化不顯著。

表1 L.casei Zhang在不同培養(yǎng)代數(shù)的菌體產(chǎn)酸活力變化(U)Table 1 Acid-producing ability of L.casei Zhang of different generations

3 討論

近年來，關(guān)于微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化特性的研究越來越多，早期有對(duì)單細(xì)胞藻類的研究［21］，還有利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)酵母進(jìn)化特性進(jìn)行研究［22］。一般來說，在微生物進(jìn)化過程中，必然的會(huì)發(fā)生菌株變異，從而導(dǎo)致菌株部分特性的改變，這也是進(jìn)化的必然趨勢。例如，Merry等人對(duì)土壤細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化1 000代進(jìn)化特性的觀察發(fā)現(xiàn)群體細(xì)胞長度有增加的現(xiàn)象［23］。此外，對(duì)大腸桿菌連續(xù)傳代40 000～50 000代進(jìn)化特性研究發(fā)現(xiàn)中，其平均適應(yīng)性呈現(xiàn)遞增趨勢，其中增加最多達(dá)3%［24］。除了菌株適應(yīng)性增長之外，還有一些顯著的表性特征的改變，如細(xì)胞的體積隨著傳代的進(jìn)行呈現(xiàn)增加趨勢?；蛘呤蔷湫螒B(tài)比原始菌株形狀更圓等［25］。這些表觀特性的變化可能是細(xì)菌為了更好地適應(yīng)環(huán)境而做出的“自我改變”。

與其他人研究結(jié)果不同的是，在對(duì)益生菌L.casei Zhang在普通MRS培養(yǎng)基中傳代1 000～2 000代期間實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化特性的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株的表觀特性包括細(xì)胞形態(tài)、活菌數(shù)、濁度和菌株活力等指標(biāo)均未發(fā)生顯著變異，而且保持著幾乎平行的進(jìn)化趨勢。由此可以側(cè)面反映出L.casei Zhang是一株相對(duì)穩(wěn)定的益生菌菌株。但是，由于實(shí)驗(yàn)所測指標(biāo)仍然存在一定局限性，該結(jié)果并不能夠全面評(píng)價(jià)該菌株的進(jìn)化特性。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，益生菌L.casei Zhang在正常培養(yǎng)條件下3個(gè)譜系間表性特征進(jìn)化趨勢相對(duì)平行，然而，這些進(jìn)化特性的結(jié)果仍存在局限性。一方面，細(xì)菌由于世代時(shí)間較短，繁殖迅速，即使出現(xiàn)某些突變，也可能會(huì)在短期內(nèi)消失，這就給研究帶來一定困難，另一方面，本實(shí)驗(yàn)傳代時(shí)間較短，而菌株的一些特性需要突變不斷積累才會(huì)表現(xiàn)出來，這也需要更充足的數(shù)據(jù)來驗(yàn)證?？傮w來說，這些數(shù)據(jù)雖不能全面說明L.casei Zhang在生理學(xué)特性方面是否發(fā)生了微妙的變化，但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然可以作為評(píng)價(jià)該菌株進(jìn)化特性的有力依據(jù)，也可為該菌株的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供很好的保障。

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