鄭朋朋，楊宏杰，寧露娟，陳玉惠，敖新宇

(西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明，650224)

鮮牛奶中蛋白質(zhì)及其他含氮物質(zhì)在牛奶中的含量即氮含量，是鮮牛奶品質(zhì)的重要指標［1］。目前，牛奶氮含量測定一般采用國標凱氏定氮法。該方法是氮含量測定的國際通用方法，適用樣品廣泛，測定結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，但存在試劑消耗量大、檢測時間長、操作復雜等缺點［2-4］。本研究在國標凱氏定氮法原理的基礎(chǔ)上，利用FOSS-2300全自動定氮儀，對牛奶氮含量的測定試驗中的濃硫酸量、催化劑量、消化溫度、消化時間、NaOH用量5個因素進行統(tǒng)計學篩選和響應(yīng)面優(yōu)化，確定鮮牛奶氮含量測定的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

鮮牛奶:昆明雪蘭牛奶責任有限公司。

1.1.2 試劑

濃 HCl、Na2SO4、溴甲酚綠、甲基紅、H3BO3、NaOH、K2SO4、CuSO4、濃 H2SO4，均為分析純。

1.1.3 儀器

全自動定氮儀(FOSS-2300)，瑞典福斯分析儀器有限公司;消化儀(FOSS-2300)，瑞典福斯分析儀器有限公司;電子天平(BS224S)、移液槍(Eppendorf)德國;電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9240A)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

鹽酸標準溶液的配制:取濃HCl加蒸餾水稀釋到一定體積，使HCl溶液濃度在0.1 mol/L左右，準確稱取Na2SO4(105℃烘箱中恒重)，溶解后定容，取20 mL Na2SO4溶液，滴2滴甲基橙指示劑，用粗配的鹽酸溶液滴定，記錄HCl溶液消耗的體積，計算HCl溶液的準確濃度。

硼酸緩沖液:稱取100 g H3BO3，用10 L蒸餾水溶解。

指示劑:分別稱取0.1 g溴甲酚綠和甲基紅，均用100 mL無水乙醇溶解，超聲10 min，過濾后，取100 mL溴甲酚綠和70 mL甲基紅混合均勻，再與H3BO3緩沖液混合。

40%NaOH配制:稱取8 kg NaOH加蒸餾水使體積為20 L。

1.2.2 最佳取樣量的確定

在常規(guī)操作條件下(催化劑量5 g、濃H2SO4量8 mL、消化溫度420℃、消化時間 240 min，40%NaOH 用量50 mL)，分別取 1、2、4、6、8 mL 鮮牛奶樣品進行消化和測定，對測定結(jié)果進行分析，得到最佳取樣量。

1.2.3 Plackett Burman試驗

對催化劑量、濃H2SO4量、消化溫度、消化時間、40%NaOH用量5個因素進行Plackett Burman試驗設(shè)計［5-6］。選擇試驗次數(shù)N=8，每個因素選擇高低2個水平，高水平取低水平的1.25倍，氮含量(mgN/mL)為響應(yīng)值。試驗結(jié)果通過Design-Expert8.0.6軟件進行主效應(yīng)分析，從而篩選出對實驗影響最大的3個因素。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Plackett Burman試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Plackett Burman experimental factors and levels design

1.2.4 最陡爬坡試驗

對Plackett Burman試驗主效應(yīng)分析中的貢獻值最大3個因素設(shè)計并進行最陡爬坡試驗。根據(jù)各因素效應(yīng)的大小設(shè)定變化的方向及步長。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，采用Desigin-Expert8.0.6軟件中 Box-Behnken中心組合設(shè)計原理［7-8］，選取催化劑量、消化溫度和消化時間3個影響因素，分別用A、B、C表示3個因素，并以 -1、0、1代表因素的3個水平，氮含量(mgN/mL)為響應(yīng)值，采用3因素3水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，響應(yīng)面因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

在響應(yīng)面優(yōu)化試驗建立的模型的基礎(chǔ)上預測最佳的測定條件，并在預測最佳的測定條件下進行穩(wěn)定性試驗，檢驗預測值與實際值的差別及在此條件下測定值的穩(wěn)定性;比較FOSS法與國標法穩(wěn)定性的差異，穩(wěn)定試驗采用9個重復，并對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

1.2.7 回收率試驗

采用4種已知濃度的有機氮標準物質(zhì)溶液模擬鮮牛奶，在最佳的測定條件下，每組設(shè)5個重復，進行回收率試驗，檢驗在最佳的測定條件下測定值的可信度，并與國標法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳取樣量

由圖1可見，鮮牛奶取樣量從1～8 mL時氮含量測定值不斷減小。取樣量增加而其他條件不變的情況下，濃H2SO4和催化劑不能完全將鮮牛奶中的有機氮消化，從而導致氮含量測定值偏低，所以在試驗組里1 mL取樣量是最佳的，考慮到實際操作，在此后的試驗中取樣量均為1 mL鮮牛奶。

圖1 取樣量與測定值的關(guān)系Fig.1 Relationship between sample volume and the measured values

2.2 Plackett Burman試驗

2.2.1 Plackett Burman試驗設(shè)計與結(jié)果(表3)

表3 Plackett Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Plackett Burman experimental design and results

2.2.2 Plackett Burman試驗結(jié)果分析

通過Design-Expert8.0.6軟件對Plackett Burman試驗結(jié)果進行主效應(yīng)分析，分析結(jié)果見表4。

表4 各因素的主效應(yīng)分析Table 4 Analysis of the main effects of each factor

由表4可見，催化劑量、消化溫度、消化時間3個因素貢獻值最大，是氮含量測定的主要影響因素。其對氮含量測定影響的大小為消化溫度＞催化劑量＞消化時間，因此選取這3個因素進行最陡爬坡試驗。

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Steepest ascent experimental design and results

由表5的最陡爬坡試驗的試驗結(jié)果可知，最優(yōu)的操作條件在試驗3和試驗5的試驗條件之間，故以試驗4的試驗條件作為響應(yīng)面設(shè)計的中心點(即0)，試驗3、試驗5的條件分別作為-1和1，進行響應(yīng)面設(shè)計和優(yōu)化試驗。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果

運用Desigin-Expert8.0.6軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計原理設(shè)計試驗，以氮含量/(mgN/mL)為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平共15個試驗點，其中12個為析因點，3個為零點，試驗設(shè)計與結(jié)果見表6。

2.4.2 回歸模型建立與方差分析

運用Design-Expert8.0.6軟件對表6中的試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，建立二次多項式回歸模型，并對模型進行方差分析，結(jié)果如表7所示。二次多項式回歸方程:含氮量 =5.72+0.055A+0.011B-0.011C-0.028AB-0.068AC+0.030BC-0.11A2-0.048B2-0.071C2。

表6 響應(yīng)面優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Box-Behnken design matrix and experimental results

由表7的方差分析可知，該回歸模型達到顯著水平(P＜0.05)。模型中的A2對響應(yīng)值影響極顯著(P ＜0.001);A、AC、、B2、C2對響應(yīng)值影響顯著(P ＜0.05)，其他項系數(shù)均不顯著(P＞0.05)，這表明試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。此模型的決定系數(shù)R2=0.976 2，R2Adj=0.933 3說明響應(yīng)值的變化有97.62%來源于所選變量，該方程與實際情況擬合良好，實驗誤差小，能夠正確反映氮含量測定值與測定條件催化劑、消化溫度、消化時間之間的關(guān)系。失擬項P=0.315 2＞0.05，差異不顯著，表明建立的二次多項式回歸模型能運用于鮮牛奶氮含量測定條件的優(yōu)化及預測。

2.4.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

對表7的結(jié)果作響應(yīng)面分析，見圖2～圖4。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis for the regression model

圖2 催化劑、消化溫度對氮含量測定影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Responsive surfaces and contours of catalyst，digestion temperature impact on the determination of the nitrogen content

圖3 催化劑、消化時間對氮含量測定影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Responsive surfaces and contours of catalyst，digestion time impact on the determination of the nitrogen content

圖2～圖4直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處?？梢钥闯龃呋瘎┝?A)與消化時間(C)之間的交互作用最為顯著，其次是消化溫度(B)與消化時間(C)。比較3組圖可知，催化劑量對氮含量的測定影響最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;消化溫度、消化時間的影響則不明顯。

圖4 催化劑、消化時間對氮含量測定影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and contours of digestion temperature，digestion time impact on the determination of the nitrogen content

選擇合適的催化劑量、消化溫度、消化時間可獲得較高氮含量測定值，通過Design-Expert8.0.6軟件分析，預測最佳測定條件為:催化劑量8.32 g，消化溫度398.95℃，消化時間230.27 min，在此條件下，理論氮含量為5.729 3 mgN/mL。

2.5 穩(wěn)定性試驗

考慮到儀器的性能和實際操作的方便，將各測定條件修正為:催化加量8.3 g，消化溫度399℃，消化時間230 min，在修正條件下進行驗證試驗，試驗結(jié)果見表8。

表8 穩(wěn)定性試驗結(jié)果與分析Table 8 Stability test results and analysis

由表8可見，在最佳測定條件下進行穩(wěn)定性試驗，測定值穩(wěn)定，標準誤差0.005 74，在誤差范圍內(nèi);測定的平均值為5.721 5 mgN/mL，與理論值的相對誤差為0.136%，說明響應(yīng)面模型能正確預測測定條件;FOSS法與國標法相比較，試驗結(jié)果的穩(wěn)定性更高。

2.6 回收率試驗(表9)

表9 回收率試驗結(jié)果與分析Table 9 Recovery test results and analysis

由表9可見，采用4種標準物質(zhì)進行回收率試驗的結(jié)果均在誤差允許范圍內(nèi)，F(xiàn)OSS法與國標法相比較，F(xiàn)OSS法在最佳測定條件下的氮含量測定值更能正確反映樣品中的真實值水平。

3 結(jié)論

通過Plackett Burman試驗對影響鮮牛奶氮含量測定的5個因素進統(tǒng)計學篩選，而后進行最陡爬坡試驗，從而確定響應(yīng)面優(yōu)化試驗的因素和水平，最后由響應(yīng)面優(yōu)化試驗獲得FOSS-2300全自動定氮儀測定氮含量的最佳條件。結(jié)果表明:催化劑量、消化溫度、消化時間對鮮牛奶氮含量測定的影響不是簡單的線性關(guān)系，由此建立的回歸模型擬合程度良好，理論值和預測值基本一致;FOSS法與國標法相比，穩(wěn)定性和回收率更高，因此FOSS法可以應(yīng)用于對鮮牛奶氮含量的測定，具有實用價值。

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