叢賀，周廣亮，金梅花，沈明花

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉，133000)

榛蘑(Armillaria mellea)為真菌植物門真菌蜜環(huán)菌的子實(shí)體，主要分布于我國(guó)的黑龍江、吉林、河北等地，具有祛風(fēng)活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨、鎮(zhèn)靜等功效。有關(guān)榛蘑生物活性的研究報(bào)道較少，其內(nèi)容主要是抗氧化［1］、抗衰老［2］、抗腫瘤［3］、抗炎［4］、免疫調(diào)節(jié)［5］、纖溶［6］等作用。本研究通過建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷大鼠模型，探討榛蘑菌多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與試劑

1.1 藥材與試劑

野生榛蘑，采自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)。FactorⅧ兔抗體、FITC-IgG羊抗兔熒光二抗，購(gòu)自凱基試劑公司;t-PA、AT-Ⅲ、6-keto-PGE1α和 TXB2試劑盒，購(gòu)自上海市嚴(yán)謹(jǐn)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

180～250 g的雌雄各半SD大鼠(清潔級(jí))共48只，購(gòu)買自延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(吉)2011-0007。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，在恒溫(20～24℃)，相對(duì)濕度為50% ～55%，自由進(jìn)食飲水。

1.3 儀器

RT-2100型酶標(biāo)儀，深圳雷杜公司產(chǎn)品;奧林巴斯BX53倒置熒光顯微鏡，日本奧利巴斯株式會(huì)社產(chǎn)品;5308型全自動(dòng)離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 榛蘑菌多糖

水提醇沉法［1］提取多糖，得率為2.2%。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將48只大鼠隨機(jī)分為6組，設(shè)正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、用藥低、中、高劑量組(10、20、40 mg/100 g，以體質(zhì)量計(jì))。陽(yáng)性對(duì)照組以23 mg/100 g(以體質(zhì)量計(jì))劑量灌胃復(fù)方丹參片溶液，用藥組按不同劑量灌胃榛蘑多糖，正常組和模型組灌胃等容生理鹽水，每日灌胃給藥1次，連續(xù)7d。將1 mg/mL的鹽酸腎上腺素用0.9%生理鹽水稀釋1.5倍后，以0.05 mL/100 g標(biāo)準(zhǔn)，從第3 天開始每日的8∶00 am、12∶00 am、4∶00 pm給模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和用藥組大鼠在皮下注射鹽酸腎上腺素。正常組以生理鹽水代替，連續(xù)注射5 d，并在最后2 d每2次注射間隔將大鼠放入0℃的冰水中冰泳5 min，共4次。

末次給藥的第2天，將大鼠用20%烏拉坦麻醉后心臟取血。獲得的血液樣本分為2份，取2.5 mL用于檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)，另一部分用于血漿指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 測(cè)定方法

以 Hladovec［7］法和免疫熒光法［8］檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，其他指標(biāo)均按試劑盒說明書操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 榛蘑多糖對(duì)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的影響

結(jié)果見表1和圖1。

如表1所示，模型組的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)比正常組明顯上升，說明內(nèi)皮細(xì)胞損傷大鼠模型制備成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和中、高劑量用藥組的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，具有顯著性差異。

表1 榛蘑多糖對(duì)血瘀模型大鼠循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的影響Table 1 The effect of Armillaria mellea polysaccharides on the number of circulating endothelial cells in rats with blood stais syndrome

免疫熒光法測(cè)定循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的結(jié)果表明，用藥組不同程度地減少外周血中的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)(見圖1)，與表1的結(jié)果相符。

圖1 免疫熒光法觀察循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)(×40)Fig.1 The number of circulating observed with immunofluorescence method

3.2 榛蘑多糖對(duì) t-PA、AT-Ⅲ、6-keto-PGE1α和TXB2的影響

如表2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，榛蘑多糖用藥組的t-PA、AT-Ⅲ的含量顯著高于模型組，TXB2水平低于模型組。6-keto-PGE1α水平陽(yáng)性對(duì)照組高于模型組，而用藥組變化不明顯。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，用藥組的6-keto-PGE1α水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組。

表2 榛蘑多糖對(duì)血瘀模型大鼠t-PA、AT-Ⅲ、6-keto-PGE1α和TXB2的影響Table 2 The effect of polysaccharides from Armillaria mellea on levels of t-PA，AT-Ⅲ，6-keto-PGE1α and TXB2

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用腎上腺素合并冷刺激的方法建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型［9］，觀察了榛蘑多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cells，CECs)指外周血中的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VEC)。正常情況下，外周血中CECs數(shù)量極少，而在發(fā)生炎癥、感染、免疫應(yīng)答反應(yīng)、腫瘤形成或心血管疾病等情況下，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量可明顯增加。因此，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞是判斷血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的特異而直接的指標(biāo)［10］。本研究中模型組的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯升高，這就說明腎上腺素合并冰浴的不良刺激影響血管壁的穩(wěn)定性，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。陽(yáng)性對(duì)照藥物復(fù)方丹參片顯著降低了造模大鼠循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。經(jīng)不同劑量的榛蘑多糖處理后，中、高劑量用藥組的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組，說明榛蘑多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅作為血液與血管平滑肌之間的機(jī)械屏障，而且又是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官［11］。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的 PGI2、AT-Ⅲ、t-PA、PAI等生物活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)血管緊張度、抗血小板聚集以及抗凝促纖溶等過程中起著重要的作用。各種物理、化學(xué)因素可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)及功能受到影響。本實(shí)驗(yàn)中采用腎上腺素合并冷刺激的方法制備血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。腎上腺素具有強(qiáng)烈的縮血管作用，加上冰浴應(yīng)急產(chǎn)生的內(nèi)源性腎上腺素分泌升高導(dǎo)致血管痙攣加重，血壓升高，造成大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的血漿t-PA、AT-Ⅲ和PGI2的代謝產(chǎn)物-6-keto-PGE1α水平下降，這就提示內(nèi)皮細(xì)胞損傷以后其分泌功能下降。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PGI2通過抑制血小板磷脂酶A2和環(huán)加氧酶，使血栓素(TXA2)合成減少，從而抑制血小板聚集。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中模型組的血管內(nèi)皮細(xì)胞受損以后PGI2水平下降，導(dǎo)致TXA2合成增多，這就可解釋模型組的TXA2的代謝產(chǎn)物-TXB2水平升高的原因。用藥組大鼠的血漿t-PA、AT-Ⅲ水平升高，而TXB2含量下降，這就提示榛蘑多糖具有抗凝、抗血小板聚集作用。綜上所述，榛蘑多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，對(duì)心血管疾病的防治具有研究意義。

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