張彥芳，楊學(xué)山，祝霞，李潁，張莉，閆衡，韓舜愈

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅蘭州，730070)

2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州，730070)

色澤是葡萄酒口味與風(fēng)格感官品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，花色苷(anthocyanin)是干紅葡萄酒中主要呈色物質(zhì)，從葡萄果實(shí)到葡萄酒釀造過程中，花色苷始終處于復(fù)雜的動態(tài)變化之中［1-2］。Revilla 等［3］認(rèn)為，葡萄果實(shí)的花色苷組成決定了酒體的花色苷主要組成特征，而原料產(chǎn)區(qū)的氣候、土壤等自然條件及與此相適應(yīng)的栽培管理措施均對葡萄果實(shí)的品質(zhì)有影響［4］;發(fā)酵過程中，果皮中部分花色苷通過浸漬轉(zhuǎn)移到葡萄酒中，此過程中由于各種花色苷浸出速率的不同、部分花色苷的降解或聚合以及酵母細(xì)胞壁對花色苷的吸附能力不同等原因，造成部分花色苷的消失和產(chǎn)生［3-7］;蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間，花色苷變化趨于穩(wěn)定且隨著葡萄酒的成熟和陳釀，較為穩(wěn)定的聚合態(tài)花色苷逐漸增加并成為紅葡萄酒顏色的主要成分［7］。長期以來，關(guān)于干紅葡萄酒在蘋-乳發(fā)酵及陳釀過程中花色苷變化特征的研究較多，而對于原料及酒精發(fā)酵過程對花色苷變化組成影響的研究報道甚少。

甘肅河西走廊地區(qū)光熱資源充足，晝夜溫差大，非常適合釀酒葡萄的栽培［8］，同時由于該地區(qū)地形狹長，導(dǎo)致同品種釀酒葡萄原料存在較為明顯的局部產(chǎn)地差異。本研究以河西走廊東端(武威)及中部(張掖)廣泛種植的優(yōu)良釀酒品種美樂(Merlot)為試材，采用HPLC法檢測不同產(chǎn)地葡萄果皮、酒精發(fā)酵前后花色苷組成及變化規(guī)律，以期為釀造具有河西走廊產(chǎn)地特色的優(yōu)質(zhì)美樂干紅葡萄酒提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美樂葡萄，2013年10月分別采自甘肅河西走廊地區(qū)(b:甘肅國風(fēng)酒業(yè)張掖板橋鎮(zhèn)葡萄園;g:甘肅祁連酒業(yè)張掖高臺葡萄園;h:甘肅莫高酒業(yè)武威黃羊鎮(zhèn)1號葡萄園;h-r:甘肅莫高酒業(yè)武威黃羊鎮(zhèn)2號葡萄園;s:甘肅威龍酒業(yè)民勤蘇武山葡萄園)原料成熟度接近。

供試標(biāo)準(zhǔn)品:花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素3-O-葡萄糖苷(諾維信生物技術(shù)有限公司);乙腈和甲醇(色譜純);磷酸(優(yōu)級純);甲酸(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器2998 PDA和在線脫氣機(jī))，美國Waters公司;AE200電子天平，瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司;0.45 μm有機(jī)相過濾器，上海密粒膜分離技術(shù)有限公司;ELGA MK2超純水器，北京格瑞恩科技發(fā)展有限公司;H-2050R高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒葡萄原料理化指標(biāo)

(1)總糖的測定:參照GB/T15038-2006的方法。

(2)總酸的測定:參照GB/T15038-2006的方法。

(3)單寧的測定:參照NY/T1600-2008的方法，以單寧酸計。

(4)每粒果實(shí)重量，隨機(jī)選取100粒葡萄果實(shí)稱重。以上操作均重復(fù)3次。

1.3.2 釀酒葡萄果皮中花色苷的提取

挑選各產(chǎn)地成熟度相近，著色均勻葡萄，剝出果皮均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g于50 mL聚乙烯管，加入浸提液(V甲醇∶V水=1∶1，磷酸調(diào) pH 至1.95)10 mL，水浴超聲波輔助提取10 min(頻率:53 kHz)，以2 500 r/min渦旋5 min，重復(fù)提取2次，最后以10 000 r/min冷凍離心5 min，取上層清液過0.45 μm膜后待HPLC分析。

1.3.3 美樂干紅葡萄酒發(fā)酵

葡萄分選，除去枝、葉、僵果、生青果和其他雜物，使用酵母D245(拉曼公司)，采用干紅葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)工藝進(jìn)行酒精發(fā)酵［9］。各產(chǎn)地成熟度相當(dāng)葡萄原料進(jìn)行浸漬、發(fā)酵，發(fā)酵過程中對游離態(tài)SO2，pH，發(fā)酵殘?zhí)堑戎笜?biāo)進(jìn)行監(jiān)測，浸漬及酒精發(fā)酵結(jié)束分別取樣，經(jīng)0.45 μm膜過濾，供HPLC分析用。

1.3.4 葡萄果皮及酒中花色苷檢測色譜條件

HPLC條件參照陳曦等人方法［10］，采用 Zorbax SB-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流速1 mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量20 μL;檢測波長535 nm;流動相:V水∶V乙腈∶V甲酸(A=80∶10∶7;B=40∶50∶7)，洗脫梯度:B液0～15 min時為0%;15～25 min時為30%;25～30 min時為50%;30～35 min時為0%。

1.3.5 花色苷定性定量分析

以花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性定量分析。結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)［11-18］對果皮及酒中其他花色苷進(jìn)行定性并以二甲花翠素3-O-葡萄糖苷進(jìn)行定量分析。葡萄皮浸提結(jié)果計算公式［9］:

式中，X表示樣品釀酒葡萄皮中花色苷的含量，mg/g;c表示樣液中花色苷的濃度，mg/L;V表示樣品溶液最終定容體積，mL;m表示最終樣品溶液中的試樣質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地美樂葡萄原料主要理化指標(biāo)

各產(chǎn)地(b、g、h、h-r、s)葡萄原料還原糖在 224～237 g/L之間，總酸含量在3.7～4.1 g/L之間，單寧含量(以單寧酸計)在1.87～1.94 g/L范圍內(nèi)，漿果重量在1.78～1.92 g之間，各項(xiàng)理化指標(biāo)無明顯差異(表1)。

表1 不同產(chǎn)地美樂葡萄原料主要理化指標(biāo)Table 1 The main physical and chemical indicators of Merlot grapes from different regions

2.2 美樂葡萄果皮、浸漬結(jié)束及酒精發(fā)酵結(jié)束原酒中花色苷的組成

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素3-O-葡萄糖苷4種基本花色苷標(biāo)品均得到很好的分離，能滿足對其分離和定量的要求(表2)。

表2 4種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程Table 2 4 kinds of anthocyanins standard regression equation

2.2.2 美樂葡萄果皮、浸漬結(jié)束及酒精發(fā)酵結(jié)束原酒中花色苷的組成

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜的保留時間與美樂葡萄果皮中花色苷的色譜圖進(jìn)行對比，初步確定了4種基本花色苷。根據(jù)文獻(xiàn)［14-18］鑒定其他花色苷的成分，共確定了9種主要花色苷，分別為花翠素3-O-葡萄糖苷，花青素3-O-葡萄糖苷，甲花翠素3-O-葡萄糖苷，甲基花青素3-O-葡萄糖苷，二甲花翠素3-O-葡萄糖苷，甲基花青素3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷，二甲花翠素3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷，甲基花青素3-O-(6-O-對香豆酰)葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-(6-O-對香豆酰)葡萄糖苷，河西走廊不同產(chǎn)地5個葡萄園美樂葡萄花色苷種類基本一致，b、g、h、h-r和s漿果皮中總花色苷含量分別為 21.02、50.42、8.67、13.72 和 32.87 mg/g，其中以二甲花翠素3-O-葡萄糖苷含量最高。

2.2.2.1 花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、甲基花青素類和二甲花翠素類花色苷變化

根據(jù)花色苷基本組成單元將花色苷分為5類，花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、甲基花青素類和二甲花翠素類。各產(chǎn)地花翠素類花色苷相對含量在果皮中為2.83% ～5.83%，浸漬后均下降到1%以下，酒精發(fā)酵結(jié)束時為0.25% ～0.95%，其中以s產(chǎn)地下降最為明顯(圖1A);花青素類花色苷h、h-r在浸漬及酒精發(fā)酵后均未檢出，b、g、s雖有檢出但浸漬后其含量明顯降低，這可能由于花青素類花色苷含量較低且在浸漬過程中僅有少量從葡萄皮中溶出［19］(圖1B);各產(chǎn)地甲基花翠素類及甲基花青素類花色苷含量在葡萄果皮中差異明顯，b、g、h、h-r和s中甲基花翠素含量分別是 11.77%、13.89%、17.95%、11.00%和17.56%，甲基花青素含量分別是20.23%、8.23%、14.37%、14.78%和8.25%，經(jīng)過浸漬及酒精發(fā)酵后均呈現(xiàn)下降趨勢，各產(chǎn)地甲基花翠素含量均在4.75% ～7.75%之間，甲基花青素約為3%(圖1C、D);二甲花翠素類花色苷作為主體花色苷類型，b、g、h、h-r和s中相對含量在浸漬結(jié)束時由原料中 64.08%、73.00%、61.31%、69.99%、67.15%分別上 升 到 87.92%、89.54%、89.73%、91.36%、87.76%，酒精發(fā)酵結(jié)束時又大約上升了1% ～3%不等(圖1E)。

綜合圖1，浸漬結(jié)束時 b、g、h、h-r和 s中不同類型花色苷浸出程度有差異，造成酒體的花色苷組成變化，隨著酒精發(fā)酵結(jié)束，二甲花翠素類依然為主體花色苷，但上升幅度較小，其他花色苷均呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因?yàn)槎谆ù渌仡愝^其他花色苷性質(zhì)更穩(wěn)定［20］，這與 García 和 Eva 等人的研究結(jié)果一致［21］。同時，發(fā)酵過程中總花色苷含量下降，這可能是因?yàn)椴糠只ㄉ盏慕到饣蚓酆弦约敖湍讣?xì)胞壁對花色苷的吸附能力不同等原因造成［19］。

圖1 不同產(chǎn)地美樂葡萄果皮及酒精發(fā)酵前后5類花色苷組成變化Fig.1 The range of 5 derivatives Anthocyanics composition in Merlot grape skin and during vinic alcohol fermentation process in different regions

2.2.2.2 基本花色苷、乙?；惡拖愣辊；惢ㄉ兆兓?/p>

將每一產(chǎn)地樣品中9種花色苷組成按其?；绞椒譃?類:基本花色苷(未酰化)、乙?；?、香豆?；?。b、h和s基本花色苷比例浸漬后均上升約4%，而g和h-r呈現(xiàn)下降，分別由果皮中80.68%和72.62%下降為80.31%和69.03%，且各產(chǎn)地原料及酒體中均以非?；ㄉ疹愋蜑橹?圖2A)。b、g、h、hr和s葡萄果皮中乙?；惢ㄉ障鄬糠謩e是17.96%、14.09%、17.31%、15.37%和20.01%，同一產(chǎn)地葡萄園h，h-r的葡萄原料、發(fā)酵液及原酒中乙?；惢ㄉ障鄬孔兓疽恢?，而不同產(chǎn)地雖然原料的成熟度相近，但花色苷組成及變化差異明顯，這與不同產(chǎn)地的氣候、土壤等自然條件及與此相適應(yīng)的栽培管理措施對葡萄原料品質(zhì)的影響有關(guān)系［22-23］(圖2B)。b、g、h、h-r和 s果皮中香豆酰化類花色苷相對含量分別是11.03%、5.23%、16.93%、12.01%和10.75%，其中g(shù)明顯低于其他產(chǎn)地，由于各產(chǎn)地均采用相同的簡易雙蘺架，平行整形的栽培管理模式，因此地理環(huán)境可能是影響葡萄原料的主要因素［20，23-25］。張掖高臺產(chǎn)區(qū)(g)干旱少雨，日照時間長，土壤為沙礫結(jié)合型土質(zhì)，熱交換快，使得晝夜溫差加大，二甲花翠素3-O-(6-O對香豆酰)葡萄糖苷在低溫狀態(tài)下穩(wěn)定性較非酰化和乙?；ㄉ詹睿?0］，可能造成該產(chǎn)地香豆?；惢ㄉ障鄬枯^低(圖2C)。

圖2 不同產(chǎn)地美樂葡萄果皮及酒精發(fā)酵前后3類花色苷的變化Fig.2 The range of 3 derivatives Anthocyanics composition in Merlot grape skin and during vinic alcohol fermentation process in different regions

圖2表明，河西走廊 b、g、h、h-r和 s原料及酒體中花色苷主要以非?；ㄉ諡橹?，而乙酰化和香豆?；惖暮矿w現(xiàn)出了產(chǎn)地特征。本試驗(yàn)中5個葡萄園的樣品分別來自河西走廊中部(甘肅祁連酒業(yè)高臺葡萄園、甘肅國風(fēng)酒業(yè)板橋鎮(zhèn)葡萄園)和東端(甘肅莫高酒業(yè)黃羊鎮(zhèn)1號、2號葡萄園，甘肅威龍酒業(yè)蘇武山葡萄園)，相距較遠(yuǎn)，地理氣候差異較大。張掖平均海拔1 450 m，干旱少雨，日照時間長，土壤為沙礫結(jié)合型土質(zhì)，熱交換快，地下水位高，有河灌條件。武威地區(qū)光照充足，晝夜溫差大，氣候干燥，水熱系數(shù)小，土壤中速效鉀含量高。可能由于它們地理環(huán)境的差異，導(dǎo)致了河西走廊地區(qū)美樂葡萄在相同成熟度(糖、酸等)條件下原料、浸漬結(jié)束及酒精發(fā)酵結(jié)束時花色苷組成差異較大，但其中具體的影響有待進(jìn)一步研究。因此，釀造優(yōu)質(zhì)的河西走廊產(chǎn)地特色單品種干紅葡萄酒，針對不同產(chǎn)地確定葡萄原料最佳采收時間也許應(yīng)將花色苷含量作為重要參考。

2.3 花色苷主成分分析

主成分分析利用降維的思想，把多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)，是近年來葡萄酒研究方面常用的分析方法之一［24，26］。河西走廊不同產(chǎn)地主發(fā)酵過程中主要花色苷主成分得分中第1主成分占累積貢獻(xiàn)率的71.74%，花青素類、甲基花翠素類和二甲花翠素類在主成分1上貢獻(xiàn)均較大，表明每個產(chǎn)地原料，浸漬結(jié)束、酒精發(fā)酵后這3類花色苷變化各異，各產(chǎn)地有差異。同樣，按花色苷?；绞椒譃槿惖幕ㄉ罩邢愣辊；愝^基本花色苷和乙?；愒谥鞒煞?上貢獻(xiàn)較大，這與一些外國學(xué)者研究結(jié)果相似［26］，說明該類花色苷組成變化具有產(chǎn)地特征性，國內(nèi)學(xué)者蔡健等人也認(rèn)為同一品種花色苷的組成不僅具有品種特性，而且受葡萄生長地區(qū)的影響［19］(圖 3)。

圖3 不同產(chǎn)地花色苷主成分分析Fig.3 Anthocyanins in different regions defined by the PCA

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，河西走廊不同產(chǎn)地美樂葡萄果皮，原酒中均以二甲花翠素3-O-葡萄糖苷為主體花色苷，其組成具有產(chǎn)地特征。隨著浸漬及酒精發(fā)酵結(jié)束，花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、甲基花青素類花色苷相對含量出現(xiàn)不同幅度下降，而二甲花翠素類花色苷呈上升趨勢。

不同產(chǎn)地美樂干紅葡萄原酒中基本花色苷占70%～80%，比例與各產(chǎn)地原料果皮比例相近。然而不同產(chǎn)地香豆?；悈s變化幅度明顯，間接影響成就了各產(chǎn)地葡萄酒感官品質(zhì)，其在同一產(chǎn)地不同葡萄園(h、h-r)的原酒中花色苷相對含量變化基本一致。張掖高臺產(chǎn)地(g)香豆酰化含量明顯低于其他產(chǎn)地，這可能由于當(dāng)?shù)靥厥獾牡乩憝h(huán)境造成其花色苷的含量差異。

主成分分析結(jié)果表明，香豆?；愒谠诤游髯呃鹊貐^(qū)不同產(chǎn)地美樂干紅葡萄酒酒精發(fā)酵前后花色苷組成變化中貢獻(xiàn)明顯。

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