蘇菲婭，辜夕容，鄧雪梅，劉穎旎，曾清蘋，劉妍君，趙天琪

(西南大學 資源環(huán)境學院，重慶，400716)

松乳菇(Lactarius deliciosus(L.ex Fr.)Gray)，紅菇科乳菇屬，湘西稱烏松菌，又名美味松乳菇、松樹蘑、松菌、雁來菌，是在南北美洲、歐洲、亞洲、非洲［1］，以及中國的四川、重慶、貴州、云南、廣西、江蘇、浙江、湖南、湖北、河北、遼寧、吉林、青海、臺灣等地廣泛分布的一種野生食用菌類。它是一種外生菌根型食用真菌，子實體單生或叢生，常與松屬樹種如馬尾松(Pinus massoniana)、海岸松(P.pinaster)［2］、黑松(P.nigra)、樟子松(P.sylvestris)［3］等共生，自然分布于海拔200～1 500 m的溫暖濕潤、腐殖質豐富地帶。松乳菇味美細嫩，營養(yǎng)豐富，富含谷氨酸、天冬氨酸等多種氨基酸和維生素，以及P、Ca、Mg、Zn等礦物質［4］。近年來更發(fā)現(xiàn)其提取物富含生物活性物質如真菌多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、色素類化合物、甾醇、倍半萜烯等［1，5］，以及淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、酪氨酸酶、漆酶等酶類并具有褪去多種合成色素的功能［6］，對肉瘤-180和艾氏腹水癌有抑制作用［7］，是宜膳宜藥的山林之珍［8］，深受消費者喜愛，并極具開發(fā)利用價值。

目前，松乳菇主要來源于人工野外采集，遠遠滿足不了市場需求。研究者們開始探索松乳菇的人工栽培技術或液體發(fā)酵技術，以緩解這種供需矛盾。周傳云［8］、周國英［9］等采取新鮮野生松乳菇子實體進行菌種分離和純化，并初步了解了其培養(yǎng)特性;李靜［10］、林親雄［11］、廖曉初［12］、龍芳［4］等分別探索了氮源、碳源和氮源、氮源、生長調節(jié)物質對松乳菇菌絲生長的影響，以確定適宜松乳菇菌絲生長的最佳培養(yǎng)基組成。并且周傳云［8］、李文藝［13］、吳連旺［14］等還利用松木屑、松針浸出液等材料制作栽培種，以進行人工栽培，但均未獲得子實體。Parlade等［2］利用松乳菇是外生菌根型食用真菌的特性，將其接種于海岸松林下而獲得子實體，Guerin-Laguette等［15］也將松乳菇接種于輻射松(Pinus radiata)而獲得子實體，他們都實現(xiàn)了松乳菇的仿生栽培。李倩茹［16］、李磊［17］直接對松乳菇進行發(fā)酵培養(yǎng)以提取有效成分或制作成飲料。無論是發(fā)酵培養(yǎng)或是仿生栽培，都離不開松乳菇菌絲體的培養(yǎng)。在前人探索培養(yǎng)基組成中，研究最多的碳源、氮源，且主要考慮了它們對菌絲體生長的影響，而對其礦質營養(yǎng)或其他功能成分的吸收和積累則少有探索。P是合成菌體細胞和一些功能性物質必不可少的原料［18］，但目前關于P對松乳菇生長的影響還少有報道。鑒于此，試驗在成功分離純化松乳菇的基礎上，設置了碳源、氮源、磷量的三因素三水平正交試驗，以探索三者對松乳菇菌絲體生長和礦質營養(yǎng)的影響，尋找能促進松乳菇生長和礦質營養(yǎng)積累的優(yōu)化培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗選用采自重慶市縉云山國家級自然保護區(qū)的馬尾松林下，經(jīng)分離純化并鑒定的松乳菇Ld3為供試菌株，該菌在Pachlewski固體培養(yǎng)基上的菌絲分泌物為紫紅色。取保存菌株接種于Pachlewski固體培養(yǎng)基，(25±1)℃培養(yǎng)21 d備用。固體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20 g/L、酒石酸銨0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、M 一 SO40.5 g/L、VB10.1 g/L、微量元素 1 mL/L(H3BO38.45 mg、M 民 SO45 mg、F 有 SO46 mg、C 產(chǎn)SO40.625 mg、ZnSO4/ZnCl22.77 mg、(NH4)2Mo4O130.27 mg)，瓊脂 20 g/L，pH值 5.8。無瓊脂時為Pachlewski液體培養(yǎng)基。

1.2 試驗設計

以Pachlewski為基本培養(yǎng)基，選用L9(34)正交表，按表1設置碳源、氮源和磷量三因素三水平試驗。在前期單因子篩選試驗基礎上，所選碳源及其用量分別為:葡萄糖20.0 g/L、可溶性淀粉18.0 g/L、蔗糖19.9 g/L，使培養(yǎng)基中碳含量均為8.0 g/L;所選氮源及其用量分別為:酒石酸銨0.5 g/L、尿素0.16 g/L、谷氨酸0.8 g/L，使培養(yǎng)基中氮含量均為0.08 g/L。所用磷由磷酸二氫鉀提供，用量分別為0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L。以Pachlewski液體培養(yǎng)基中的碳源、氮源及磷量為對照。

表1 正交試驗設計的因素和水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design

將上述因素及水平按L9(34)正交表配制成9種液體培養(yǎng)基，分裝于150 mL三角瓶中(20 mL/瓶)，封口膜封口后于121℃高溫高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至室溫。于超凈工作臺上分別接種直徑約4 mm的供試瓊脂菌種1塊。(25±1)℃ 黑暗條件下靜置培養(yǎng)21 d。試驗作3次，每處理設5次重復，取平均值。

以上所用試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

LDZX-50KB高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;JJ-CJ-2F超凈工作臺，吳江市凈化設備總廠;RXZ-310B培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司;202-2A烘箱，天津市泰斯特儀器有限公司;FA2004天平，上海越平科學儀器有限公司;W-5200可見分光光度計，上海元析儀器有限公司;FP6410火焰光度計，上海欣意儀器有限公司;TAS-990 AFG原子吸收分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.4 測定項目與方法

培養(yǎng)結束后，過濾收集菌絲，去離子水洗凈，(80±1)℃ 烘至恒重，稱重(精確到0.000 1 g)。然后用HNO3-HClO4法消化菌絲，分別用鉬銻抗比色法測磷，火焰光度計法測鉀，原子吸收分光光度法測鈣、鎂、鐵、鋅和錳的含量［19］。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件作方差分析，SSR法作數(shù)據(jù)間的多重比較，Pearson法作相關分析。顯著水平設置為0.05。用Microsoft Excel 2010制作圖表。

2 結果與分析

2.1 松乳菇菌絲體的生物量、礦質養(yǎng)分含量及差異分析

松乳菇Ld 3在培養(yǎng)21 d后菌絲體的生物量(干重)及礦質養(yǎng)分含量見表2。所測定的8個項目中，除錳含量的變異系數(shù)稍小，僅為9.84%外，其他指標的變異幅度均超過10%，由大到小依次為:K(54.10%)＞Ca(37.18%)＞Zn(30.57%)＞P(20.31%)≥生物量 (20.10%)＞Fe(13.93%)＞Mg(12.68%)＞Mn(9.84%)?？梢?，由碳源、氮源、磷量三因素三水平組成的9種培養(yǎng)基對松乳菇菌絲體的生物量及礦質養(yǎng)分含量均有明顯影響，可用上述8個指標對培養(yǎng)基進行篩選和優(yōu)化。

表2 松乳菇菌絲體的生物量、礦質養(yǎng)分含量及差異分析Table 2 Variations of biomass and mineral nutrition content in mycelium of Lactarius deliciosus

2.2 碳源、氮源、磷量對松乳菇菌絲體生長和礦質營養(yǎng)的影響

2.2.1 碳源對松乳菇菌絲體生長和礦質營養(yǎng)的影響

表3可見，碳源不同，松乳菇菌絲體的生長和P、K、Zn 含量差異顯著，但 Ca、Mg、Fe、Mn 含量卻無明顯差異。3種碳源中，效果最好的是可溶性淀粉，其次是蔗糖，最差的是葡萄糖。和培養(yǎng)菌根真菌常用的碳源葡萄糖相比，可溶性淀粉可令松乳菇生物量增加32.20%，P、K、Zn含量分別增加 16.94%、182.81%、59.09%，說明可溶性淀粉比葡萄糖更適于松乳菇菌絲體的生長和P、K、Zn的吸收。

表3 碳源對松乳菇菌絲體生長和礦質養(yǎng)分含量的影響Table 3 Effect of carbon sources on the biomass and mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.2.2 氮源對松乳菇菌絲體生長和礦質營養(yǎng)的影響

氮源不同，培養(yǎng)出的松乳菇菌絲體生物量與P、K、Mg、Fe、Mn含量差異明顯，Ca和 Zn含量未受明顯影響(表4)。3種氮源中，酒石酸銨最利于菌絲體生物量積累，尿素最利于菌絲體對磷和鉀的吸收，谷氨酸最有利于菌絲體對Mg、Fe、Mn的吸收。與谷氨酸相比，酒石酸銨可使松乳菇生物量增加27.29%，尿素可令松乳菇菌絲體的P、K含量分別增加7.74%、34.26%;與酒石酸銨相比，谷氨酸可令菌絲體的Mg、Fe、Mn含量分別增加17.95%、26.75%、20.18%。

表4 氮源對松乳菇菌絲體生長和礦質養(yǎng)分含量的影響Table 4 Effect of nitrogen sources on the biomass and mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.2.3 磷量對松乳菇菌絲體生長和礦質營養(yǎng)的影響

表5可見，培養(yǎng)基中KH2PO4量的多寡顯著影響松乳菇的生物量積累和 P、K、Mg、Mn、Zn的吸收，但對菌絲體Ca和Fe的吸收無明顯作用。P量的三水平中，以0.5 g/L最適于松乳菇菌絲體的生長和對P、K、Mg、Zn的吸收。與常用量1.0 g/L相比，0.5 g/L KH2PO4可令松乳菇菌絲體生物量增加8.42%，P、K、Mg、Zn含量分別增加 42.89%、31.97%、20.85%、54.52%。2.0 g/L KH2PO4僅在對Mg的吸收上顯著優(yōu)于另2種P水平。

表5 磷量對松乳菇菌絲體生長和礦質養(yǎng)分含量的影響Table 5 Effect of phosphorus dosage on the biomass and mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.2.4 碳氮比、碳磷比、氮磷比與松乳菇菌絲體生長和礦質營養(yǎng)的關系

根據(jù)培養(yǎng)基的組成及含量，計算出C/N比、C/P比及N/P比，并獲得它們與松乳菇菌絲體生物量和礦質養(yǎng)分含量間的相關系數(shù)(表6)?？梢钥闯觯珻/N比除與生物量有較顯著的負相關關系(P=0.093)外，與礦質養(yǎng)分含量間無明顯相關;而C/P比、N/P比則只與P含量、Zn含量有顯著正相關，與生物量及其他礦質養(yǎng)分含量間關系均不顯著。由此表明，在試驗給定范圍內，培養(yǎng)基中的C/N比增加不利于松乳菇的生長，而C/P比和N/P比增加有利于菌絲體對P和Zn的吸收。

表6 碳氮比、碳磷比、氮磷比與松乳菇菌絲體生長和礦質養(yǎng)分含量間的相關性Table 6 Pearson correlations between C/N，C/P，N/P and biomass，mineral nutrition content of Lactarius deliciosus

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

從各指標在碳源、氮源和磷量各水平間的極差(表7)可看出，松乳菇的生物量、K含量、Ca含量受碳源影響最大，F(xiàn)e和Mn含量受氮源影響最大，P、Mg和Zn含量受磷量影響最大。結合多重比較結果(表3、表4、表5)可以得出，有利于松乳菇生長的最佳組合是A2B1C3(可溶性淀粉 +酒石酸銨 +0.5 g/L KH2PO4)，有利于菌絲體吸收 P、K、Ca、Zn的最佳組合是 A2B2C3(可溶性淀粉 +尿素 +0.5 g/L KH2PO4)，有利于菌絲體吸收鎂、鐵的最佳組合是A2B3C3(可溶性淀粉+谷氨酸+0.5 g/L KH2PO4)，有利于菌絲體吸收錳的最佳組合是A2B3C3(可溶性淀粉+谷氨酸+2.0 g/L KH2PO4)。綜合考慮菌絲體的生長、礦質營養(yǎng)的積累以及培養(yǎng)成本，A2B1C3(可溶性淀粉+酒石酸銨+0.5 g/L KH2PO4)應是松乳菇菌絲體培養(yǎng)的最優(yōu)組合。

表7 正交試驗結果的極差分析Table 7 Range analysis on data from orthogonal experiments on cultivation of Lactarius deliciosus

3 討論與結論

碳是構成食用菌細胞和代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質，也是食用菌生命活動所需要的能源。在松乳菇菌絲培養(yǎng)過程中，使用較多的碳源有葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、半乳糖、木糖、麥芽糖、乳糖、糊精、淀粉、玉米粉等［9，11，20-21］，被認為合適的碳源有葡萄糖［14］、麥芽糖［20-21］、蔗糖［9］、可溶性淀粉［11］等。試驗發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉為最佳碳源，其促生效果優(yōu)于葡萄糖32.20%，與林親雄等［11］得到的最適碳源為可溶性淀粉較一致，而與吳連旺等［14］認為葡萄糖是最佳碳源的結果差異較大。這可能與所使用的碳源有關。當無可溶性淀粉時，其他單糖或二糖被認為是最佳碳源，而有可溶性淀粉時，葡萄糖或蔗糖則稍次。另外，菌株不同，適用碳源也有差異。本試驗用的是松乳菇Ld 3，吳連旺等［14］在作最優(yōu)碳源試驗時，使用的菌株是Ld 1，這也可能導致了最終結果的不同。Ld 3在可溶性淀粉為碳源時的生長和礦質元素含量均優(yōu)于葡萄糖和蔗糖，即該菌株利用多元糖的效果好于單糖和二糖，說明其分泌胞外酶如淀粉酶的能力較強，這也可能是Khaund等［6］認為可利用松乳菇生產(chǎn)淀粉酶的原因之一。

松乳菇能利用的氮源較多，主要有蛋白胨、硝酸鉀、乙酸銨、硫酸銨、酒石酸銨、甘氨酸等。對于哪種氮源更適于松乳菇生長，分歧較大。如廖曉初等［12］認為硝態(tài)氮比銨態(tài)氮合適，但周國英等［9］卻認為銨態(tài)氮優(yōu)于硝態(tài)氮;林親雄等［11］則認為蛋白胨和KNO3都是最佳氮源，但周傳云等［8］卻認為蛋白胨是最好氮源，硝酸鉀次之，吳連旺等［14］發(fā)現(xiàn)KNO3為氮源的菌絲長勢不好。試驗發(fā)現(xiàn)，最適于松乳菇生長的是酒石酸銨，同時尿素和谷氨酸都適于松乳菇生長，只是效果稍差。在礦質養(yǎng)分吸收方面，3種氮源各有所長:谷氨酸對鎂、鐵、錳，尿素對磷、鉀上都優(yōu)于另2種氮源。至于何種氮源更合適，應與所用菌株或培養(yǎng)基有關，而且礦質營養(yǎng)或其他活性物質的積累可能對氮源的要求也不盡相同，這還需要進一步研究。

磷在食用菌生長過程中能很快被吸收，在細胞內用于核酸磷脂和核苷酸的合成。試驗發(fā)現(xiàn)，供給少量磷(0.5 g/L)時，松乳菇的生長和對 P、K、Mg、Zn 的吸收都最佳，而且C/P比、C/N比越高，菌絲體的磷含量也越高，結果與薛小平等［22］得到的結果較一致。松乳菇是一種外生菌根型食用真菌，自然生長于酸性缺磷土壤［23］，長期的適應可能使某些株系能溶解難溶性磷供自身利用［18］，這也可能正是松乳菇在少磷水平下生長更好的原因之一。

按L9(34)正交表設計的9種培養(yǎng)基組合對松乳菇生長和礦質營養(yǎng)吸收均有明顯影響。三因素對8個指標的影響重要性各不相同:碳源主要影響菌絲體生長和K、Ca的吸收，氮源主要影響Fe、Mg的吸收，P量主要影響P、Mg、Zn的吸收。在碳源的三水平中，效果最好的是可溶性淀粉，其次是蔗糖，最差的是葡萄糖;在氮源的三水平中，對生長最有利的是酒石酸銨，對P、K吸收最有利的是尿素，對Mg、Fe、Mn吸收最有利的是谷氨酸;在磷量的三水平中，0.5 g/L KH2PO4最適于菌絲體生長和對P、K、Mg、Zn的吸收。最適于松乳菇菌絲體生長和礦質營養(yǎng)吸收的優(yōu)化培養(yǎng)基組合是:可溶性淀粉 +酒石酸銨 +0.5 g/L KH2PO4。

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