馬靜蓉，楊賢慶，馬海霞，陳勝軍，黃卉

1(廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江，524088)

2(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州510300)

鳶烏賊(Symplectoteuthis oualaniensis)屬于鞘亞綱，槍形目，柔魚科，其生命周期短、生長率高、繁殖力強，是一種極具開發(fā)潛力的頭足類資源。其資源豐富，在印度洋、太平洋的赤道和亞熱帶海域廣泛分布，其中分布在南海和印度洋西北部海域的數(shù)量較大，據(jù)報道其可食部分高達80%以上，較其他已開發(fā)的頭足類動物都高［1］。

隨著傳統(tǒng)漁業(yè)資源的衰退以及我國遠洋漁業(yè)的飛速發(fā)展，我國南海豐富的鳶烏賊資源被開發(fā)，其高值化加工利用成為了當前的熱點問題。南海鳶烏賊高蛋白低脂肪，能滿足人們對海洋蛋白的需求;含有豐富的氨基酸，肉美味鮮;豐富的DHA、EPA及鋅鐵元素，具備一定的保健功效［2］。目前國內(nèi)外學者研究較多的頭足類加工主要是墨魚、秘魯魷魚、阿根廷魷魚、太平洋褶柔魚等，對其肌肉的加工產(chǎn)品主要有魷魚絲、魷魚粒、燒烤類以及更高值化的魚糜制品，而對鳶烏賊特別是南海鳶烏賊胴體肌肉的加工研究卻鮮見報道，用鳶烏賊胴體肌肉來制備冷凍魚糜及相關的魚糜制品，不失為其高值化利用的一條可行途徑。

魚糜，是一種新型的水產(chǎn)調(diào)理食品原料，其主要成分是肌原纖維蛋白。肌原纖維蛋白是水產(chǎn)品加工中主要的利用對象，是以肌球蛋白和肌動蛋白為主體組成的可支撐肌肉運動的結(jié)構蛋白質(zhì)，具有重要生物學功能，其在魷魚等頭足類動物中所占比例高達75% ～85%［3］，除了參與肌肉的收縮外，還與肉制品的流變學特性如保水性、黏結(jié)性、質(zhì)地、彈性等有著密切的關系，其熱誘導凝膠對肉制品的結(jié)構特性起主要作用［4］。了解鳶烏賊肌肉性質(zhì)及其肌原纖維蛋白的基本性質(zhì)是利用鳶烏賊胴體肌肉制作魚糜的首要前提，因此，本文以南海鳶烏賊為研究對象，研究了其胴體肌肉的基本特性，并重點探索了溫度對其肌原纖維蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳶烏賊，來源于南海水產(chǎn)研究所“南鋒號”科考船，捕撈于南海海域，-20℃凍藏保存;NaCl，分析純，廣州化學試劑廠;三氯乙酸，分析純，天津市大茂化學試劑廠;NaH2PO4，分析純，天津市福晨化學試劑廠;Tris，分析純，天津市福晨化學試劑廠;R-250，分析純，廣州化學試劑廠;Triton X-100，分析純，廣州市博理生物科技有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，康為世紀生物科技有限公司;考馬斯亮藍R-250，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultra Turrax T50均質(zhì)機(德國IKA公司);Sigma-3K30高速冷凍離心機(德國SIGMA公司);PB-10型精密pH計(Sartorius公司);3-550A高溫馬弗爐(美國NeyVULCAN公司);Kjeltec2300全自動定氮分析儀(瑞士foss公司);DW-86L626超低溫冷柜(青島海爾特種電器有限公司);Powerpac@HV等電聚焦電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 一般成分的測定

水分測定:常壓105℃烘干至恒重(GB/T9695.15-2008);粗蛋白測定:凱氏定氮法(GB/T50095-2010);粗脂肪測定:索氏抽提法(GB/T14772-2008);灰分測定:高溫灼燒灰化法(GB/T9695.18-2008);總揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定:蒸餾法(SC/T 3032-2007);pH的測定:pH測定儀。

1.3.2 胴體肌肉各種蛋白質(zhì)成分的分離及測定

鳶烏賊胴體肌肉各種蛋白的分離方法參照Hashimoto［5］的方法進行。分離出的肌漿蛋白、肌基質(zhì)蛋白、肌原纖維蛋白、堿溶性蛋白及非蛋白氮均采用全自動凱氏定氮儀測定其含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白質(zhì)的提取［6］

取10 g碎肉加6倍的 A液(pH=7.5，0.1 M KCl，20 mmol/L Tris-HCI緩沖液)和2倍的B液(1%Triton，pH=7.5，0.1 mol/L KCl，20 mol/L Tris-HCI緩沖液)，用 IKA 勻漿機勻漿(9 600 r/min、30 s、5次)，紗布過濾，除去結(jié)締組織。再用冷凍離心機離心(4℃、8 000 r/min、15 min)，去上清液，沉淀用 8 倍的A液混合均勻離心，重復3次。最后用A液將沉淀稀釋至300 mL，即得到肌原纖維蛋白溶液，用考馬斯亮藍法測定其濃度，為避免反復凍融，將其分裝于10 mL的離心管中，貯存于-70℃超低溫冰箱中備用。

1.3.4 肌原纖維蛋白溫浴處理方法

取8 mL肌原纖維蛋白溶液于10 mL離心管中，在不同溫度下進行保溫反應，按照實驗設計的要求，取出各溫浴時間下的樣液進行測定分析。

1.3.5 不同溫度下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化

將溫浴處理后的樣品與5X的凝膠上樣緩沖液以4∶1的比例混合，煮沸10 min，放置于4℃冰箱中備用。電泳采用5%濃縮膠，10%分離膠，初始電壓80 V，當樣品進入分離膠后，將電壓增大至120 V，當溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm處，關閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍R-250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳶烏賊胴體肌肉一般成分分析

南海鳶烏賊胴體肌肉中，粗蛋白的含量為19.17%，粗脂肪含量僅為0.58%(表1)，高蛋白低脂肪，能夠很好地滿足現(xiàn)代人的膳食需求，為消費者提供優(yōu)質(zhì)的海洋蛋白。由于高濃度的非蛋白氮存在，比如揮發(fā)性鹽基氮(VBN)和三甲胺(TMA)，使得一些頭足類動物肌肉具有強烈的氨臭味，秘魯魷魚肌肉中VBN 含量最高可達 247 mg/100 g［6］，新鮮的印度洋鳶烏賊 VBN 含量為 193.7 mg/100 g［7］，然而，本實驗中的南海鳶烏賊的氣味較溫和，測定其VBN含量為53.2 mg/100 g，但仍高于國標規(guī)定的30 mg/100 g，加工時應適當清洗降低其含量。pH值在6.4～6.8之間，無怪酸味，適合用作食品加工。

表1 南海鳶烏賊胴體肌肉基本營養(yǎng)成分%Table 1 Proximate composition of the mantle muscles from Ryukyu squid in South China Sea%

2.2 鳶烏賊胴體肌肉蛋白的組成

Chu等［8］研究了阿根廷魷魚、赤魷、烏賊、章魚等幾種頭足類動物的胴體肌肉蛋白組成，研究發(fā)現(xiàn)其含有的肌原纖維蛋白為50% ～55%。由表2可知，鳶烏賊胴體肌肉中肌原纖維蛋白含量所占比例較高，對鳶烏賊的加工性質(zhì)，如凝膠性起著關鍵的作用，因此，可將南海鳶烏賊加工成魚糜及魚糜制品。鳶烏賊的肌漿蛋白含量較少，這對其持水性有影響，使得持水能力相對較弱，在以后的加工中應研究提高其持水性的方法。

表2 南海鳶烏賊胴體蛋白質(zhì)構成%Table 2 Protein composition of the mantle muscles from Ryukyu squid in South China Sea%

2.3 鳶烏賊肌原纖維蛋白在不同溫度下SDSPAGE的變化

鳶烏賊屬于頭足類動物，其肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白重鏈(MHC)、肌動蛋白(Actin)、軟體動物所特有的副肌球蛋白(PM)以及相對分子質(zhì)量更小的原肌球蛋白等［9］。如圖1～圖6，SDS-PAGE結(jié)果顯示南海鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC分子質(zhì)量大于245 kDa、PM的分子質(zhì)量在100 kDa左右、Actin分子質(zhì)量接近48 kDa。此外，還能看見重酶解肌球蛋白(HMM)和輕酶解肌球蛋白(LMM)，HMM和LMM的存在，顯示MHC發(fā)生了水解作用，可能是由于存在蛋白水解酶，使得MHC發(fā)生了分解。對比參考文獻［6，10］，可以發(fā)現(xiàn)鳶烏賊肌原纖維蛋白的 MHC分子質(zhì)量較大，所含有的PM所占的比例較阿根廷魷魚、秘魯魷魚等大，研究表明PM對魷魚等頭足類動物的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、凝膠強度等性質(zhì)有很大影響［12-13］，南海鳶烏賊肌肉蛋白中PM所占比例較大，可能會使得其肌肉的性質(zhì)相比于其他頭足類動物略有差異。

肌原纖維蛋白隨著溫度的升高、溫浴時間的延長，其SDS-PAGE會發(fā)生明顯變化，MHC、PM、Actin會有不同程度的降解，且不同溫度下降解的速度不同。

由圖1所示，在4℃條件下，雖然由于取樣的誤差導致2 h的條帶較淡，36 h的條帶顏色比較深，但從整體趨勢可以看出，48 h內(nèi)，鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC、PM、Actin等未有明顯的變化。說明在較低溫度下，鳶烏賊肌原纖維蛋白變化緩慢，在4℃下，至少可以存放2 d。

圖1 4℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.1 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 4℃

25℃時，溫浴1 h后，在分子質(zhì)量63 kDa處開始出現(xiàn)新的蛋白質(zhì)條帶，MHC在溫浴12 h后開始發(fā)生明顯的降解，24 h后基本上完全降解。PM、Actin以及較小分子質(zhì)量的原肌球蛋白等，在溫浴12 h后也開始出現(xiàn)明顯的降解，并且隨著溫浴時間的繼續(xù)延長，降解程度越來越大(圖2)。對比4℃能看到，溫度的升高對該鳶烏賊肌原纖維蛋白產(chǎn)生了較大的影響。

圖2 25℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.2 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 25℃

當溫度在40℃時，鳶烏賊肌原纖維蛋白的降解較為快速，溫浴0.5 h后，MHC發(fā)生了明顯的降解，1.5 h后基本降解完全;0.5 h時在63 kDa處出現(xiàn)了和25℃放置1 h后一樣的蛋白質(zhì)條帶;1 h時在分子質(zhì)量25 kDa處，開始出現(xiàn)新的蛋白條帶，且隨著時間的延長越來越明顯;PM、Actin降解并不明顯，可能是由于放置時間較短的原因(圖3)。

魷魚等頭足類動物，肌肉中存在大量蛋白酶，其蛋白水解活性較其他大多數(shù)的魚種都高［14］，研究發(fā)現(xiàn)這些酶主要是金屬蛋白酶［15-16］，它會選擇性的將肌球蛋白微粒分解成重酶解肌球蛋白(HMM)和輕酶解肌球蛋白(LMM)，從而導致肌肉的加工特性如凝膠性較弱。由SDS-PAGE圖分析結(jié)果可知，南海鳶烏賊肌肉中存在這樣的蛋白水解酶，使得MHC發(fā)生降解，其活性在40℃時較強。同樣，王進勉等［7］對印度洋鳶烏賊加工特性進行研究，提到印度洋鳶烏賊的肌肉蛋白質(zhì)中含有一種蛋白酶，這種酶在也是在40℃ 附近有較高活性，會降解肌球蛋白重鏈。因此，為了保持肌原纖維蛋白較完整的功能性，應盡量避免在40℃周圍對南海鳶烏賊進行加工處理。

EDTA具有螯合金屬的作用，食品級EDTA可作為金屬蛋白酶抑制劑，并已經(jīng)顯示出了能夠明顯抑制魷魚肌肉自溶的能力［17］。Konno等［16］研究發(fā)現(xiàn)，導致秘魯魷魚肌肉蛋白自溶的蛋白水解酶主要是金屬蛋白酶，當添加2 mmol EDTA，肌肉蛋白的自溶被顯著性抑制。由圖4可知，40℃時，在添加了1 mmol EDTA可以發(fā)現(xiàn)，南海鳶烏賊MHC的降解速度被明顯抑制，在放置了4 h后，仍能看到非常清晰的MHC條帶，進一步證明了，南海鳶烏賊肌肉中的確存在蛋白水解酶，主要是金屬蛋白酶，在后期加工中可以通過添加一定量的EDTA來抑制肌肉蛋白的自溶作用。

圖4 40℃水浴添加1 mmol EDTA條件下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.4 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 40℃with 1 mmol EDTA

從圖5、圖6可以看出，50、60℃溫度下的肌原纖維蛋白，MHC的降解并不明顯，溫浴3～4 h后，仍能看見清晰的MHC蛋白條帶，這種現(xiàn)象和印度洋鳶烏賊尤為相似，王進勉等［7］在研究印度洋鳶烏賊肌原纖維蛋白在不同溫度下的變化中也有提及，表明金屬蛋白酶在高溫下失活;然而，PM、Actin等卻降解得比較快速，可能是由于該溫度是鳶烏賊胴體肌肉中各種內(nèi)源酶的適宜溫度。研究發(fā)現(xiàn)，當溫度為50～70℃時，肌肉中的一些內(nèi)源性熱穩(wěn)定性蛋白酶會分解肌球蛋白，在魚糜凝膠的過程中，會導致凝膠劣化現(xiàn)象的發(fā)生［18］。因此，如若用鳶烏賊制作魚糜制品，為獲得凝膠質(zhì)量好的產(chǎn)品，應快速通關此溫度帶。

圖5 50℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.5 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 50℃

圖6 60℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.6 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 60℃

3 結(jié)論

南海鳶烏賊是一種優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)品，高蛋白，低脂肪，肌原纖維蛋白所占比例達59.63%，其氣味溫和，無怪酸味，為其制作魚糜的加工利用創(chuàng)造了可能。通過對不同溫度下肌原纖維蛋白的SDS-PAGE變化的研究表明，在4℃下，肌球蛋白重鏈(MHC)、副肌球蛋白(PM)、肌動球蛋白(Actin)48 h內(nèi)無明顯變化;25℃下，MHC溫浴12 h后開始發(fā)生明顯的降解，24 h后完全降解;40℃時，降解嚴重，溫浴0.5 h后，MHC就發(fā)生明顯的降解，1.5 h后基本上降解完全，在南海鳶烏賊胴體肌肉中存在金屬蛋白酶，它會使MHC發(fā)生降解，從而影響肌肉蛋白的加工性質(zhì)，其最適溫度為40℃，通過添加1 mmol的EDTA，可以顯著抑制該金屬蛋白酶的活性。在鳶烏賊魚糜制品的加工中，為了獲得更好的凝膠性能，應繼續(xù)研究抑制此蛋白酶的方法。

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