陳芬芳， 于紅梅， 王 瑞， 褚秀玲， 蘇建青

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000）

刺五加為中國東北多年生落葉灌木，性溫、味辛、微苦、無毒，入脾腎經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活血、益氣健脾、補(bǔ)腎安神之功效?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)研究證實(shí)，中草藥刺五加中含有皂苷、黃酮、多糖、微量元素和氨基酸等有效成分，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗疲勞和抗氧化等功效（王瑞強(qiáng)等，2013；田志浩等，2013）。刺五加多糖是從中草藥刺五加的根和莖中提取出的一種中草藥多糖 （龔婧如和王書芳，2012）。研究顯示，刺五加多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化和促進(jìn)生長等功效。本試驗(yàn)采用熱水浸提法從刺五加中抽提多糖，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝。

1 材料和方法

1.1 材料 刺五加飲片，購于聊城利民大藥房，60℃溫箱烘干后粉碎，過40目篩備用。葡萄糖、苯酚、濃硫酸，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 刺五加多糖含量的測定 刺五加多糖的測定方法采用苯酚-硫酸法，按照姜瓊和謝妤（2013）的方法略有修改。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 100 μg/mL的葡萄糖溶液：將葡萄糖置于105℃的干燥箱內(nèi)烘干至恒重，精密稱取10.0 mg至100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解混勻，定容。

6%苯酚溶液：精密稱取6.0 g苯酚，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，混勻，裝入棕色瓶中，4℃避光保存。

1.2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入9支10 mL的具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，然后每個(gè)試管中分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，最后每個(gè)試管沿管壁迅速加入7.0 mL濃硫酸，搖勻，靜置10 min后放入80℃水浴中恒溫15 min，放置室溫冷卻。將第一個(gè)試管樣品作為空白對照，在波長490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.2 刺五加多糖提取的單因素試驗(yàn) 刺五加多糖的提取采用熱水浸提法，每次稱取1.0 g刺五加粉末，加入燒瓶中，按料液比加入蒸餾水，浸泡30 min后，在水浴鍋中進(jìn)行加熱。分別考察提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取次數(shù)4個(gè)因素對刺五加多糖提取率的影響。

1.2.2.1 提取時(shí)間對刺五加多糖提取率的影響提取時(shí)間分別選擇 1.0、1.5、2.0、2.5 h 和 3.0 h，料液比、提取溫度和提取次數(shù)分別固定為1∶25、80℃和2次。將2次的提取液合并，在波長490 nm處測定吸光度（A）值。根據(jù)1.2.1的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算刺五加多糖的含量。

1.2.2.2 提取溫度對刺五加多糖提取率的影響提取溫度選擇50、60、70、80℃和90℃，料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)分別固定為1∶25（g/mL）、2 h和2次。將2次提取液合并，分別測定不同提取溫度下多糖的含量。

1.2.2.3 料液比對刺五加多糖提取率的影響 料液比選取 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 和 1∶35 （g/mL），提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)分別固定為80℃、2 h和2次。將2次提取液合并后，測定刺五加多糖的含量。

1.2.2.4 提取次數(shù)對刺五加多糖提取率的影響提取次數(shù)選擇1次、2次和3次，提取溫度、提取時(shí)間和料液比分別固定為 80 ℃、2 h 和 1∶25（g/mL）。提取后分別測定不同提取次數(shù)的提取液刺五加多糖的含量。

1.2.3 刺五加多糖提取的正交試驗(yàn) 根據(jù)刺五加多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)為考察因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取條件，并采用SPSS 13軟件對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)獲得的最佳提取工藝條件對刺五加多糖進(jìn)行提取，重復(fù)3次，分別計(jì)算多糖的提取量，考察該條件下提取刺五加多糖的提取率及變異系數(shù)，以確定試驗(yàn)結(jié)果的可行性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖測定方法的建立 以葡萄糖配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用苯酚-硫酸法測定不同濃度的葡萄糖溶液在490 nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液與其對應(yīng)吸光值的線性回歸直線如圖1所示，線性擬合方程為A=0.6653C-0.0025，R2=0.9975，試驗(yàn)表明，葡萄糖溶液濃度在0.01～0.08 mg/mL與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對刺五加多糖提取率的影響 由圖2可知，在1.0～2.0 h，刺五加多糖的提取率隨提取時(shí)間的延長而增加，最高達(dá)到18.18 mg/g，但是超過2.0 h后，多糖的量逐漸減少。分析原因可能是刺五加多糖發(fā)生了水解，或隨著提取時(shí)間的延長，刺五加中的其他雜質(zhì)成分亦被提取出來，干擾了刺五加多糖的溶解量。因此，選定2.0 h作為單因素試驗(yàn)的最佳提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對刺五加多糖提取率的影響

2.2.2 提取溫度對刺五加多糖提取率的影響 由圖3可知，當(dāng)提取溫度超過60℃以后，刺五加多糖的提取率隨溫度的升高而增加，但是在70～90℃，多糖提取率的增幅趨于平緩，70、80、90℃的提取率分別是 16.93、17.05、18.02 mg/g。 考慮到高溫會(huì)引起多糖的變性分解，因此選擇80℃作為單因素試驗(yàn)的最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對刺五加多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對刺五加多糖提取率的影響 由圖4 可知，料液比在 1∶15～1∶25（g/mL）時(shí)，刺五加多糖的提取率是逐漸增加的，1∶25（g/mL）時(shí)多糖的提取率達(dá)到了 16.87 mg/g， 但是超過 1∶25（g/mL）以后，多糖的提取率反而下降。因此，選擇最佳的料液比為 1∶25（g/mL）。

圖4 料液比對刺五加多糖提取率的影響

2.2.4 提取次數(shù)對刺五加多糖提取率的影響 通常隨著提取次數(shù)的增加，多糖的提取率逐漸升高。由圖5可知，提取1次、2次和3次，多糖的提取量分別是12.59、19.77、22.36 mg/g。所以，選擇3次作為最適提取次數(shù)。

圖5 提取次數(shù)對刺五加多糖提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)與方差分析結(jié)果見表2和表3。通過極差分析顯示提取溫度的R值最大，為4.941，其次是提取次數(shù)。根據(jù)R值的大小判定，4個(gè)因素對提取率的影響順序?yàn)樘崛囟龋咎崛〈螖?shù)＞料液比＞提取時(shí)間。通過方差分析可知，F(xiàn)（A）＜ 0.05，F(xiàn)（B）＜ 0.05，即提取次數(shù)和提取溫度對刺五加多糖的提取率影響顯著。因此，最佳提取方案確定為A3B3C2D3，即提取次數(shù)為3次，提取溫度為 90 ℃，料液比為 1∶25（g/mL），提取時(shí)間為 2.5 h。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果 在提取溫度90℃、料液比為 1∶25（g/mL）、提取時(shí)間 2.5 h、提取次數(shù) 3 次時(shí)，刺五加多糖的提取率為23.95 mg/g，RSD為1.98%（n=3），明顯高于市場平均水平，故該條件即為刺五加多糖的最佳提取工藝。

3 討論與結(jié)論

刺五加是長白山地區(qū)大宗地道中藥材，其藥用價(jià)值高，需求量較大。傳統(tǒng)的飲片利用浪費(fèi)較大，對刺五加原藥材有效成分的提取和研究，可提高藥材利用效率。刺五加多糖具有免疫增強(qiáng)和抗疲勞、抗氧化作用，是理想的免疫增強(qiáng)劑（劉樹民和張娜，2014）。如能對刺五加及其有效成分——刺五加多糖進(jìn)一步提取和純化，提高其純度，將對刺五加制劑的研究及臨床療效產(chǎn)生巨大的影響。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由于影響刺五加多糖提取的主要因素有料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和炮制方法等（孟凡欣等，2005）。本試驗(yàn)重點(diǎn)考察了料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對刺五加多糖提取率的影響，并利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了刺五加多糖的提取工藝條件，在最佳提取工藝條件下獲得的多糖含量達(dá)到23.95 mg/g。

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