蘇貴龍， 李建喜

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050)

犬感染犬瘟熱病毒后抗體的產(chǎn)生規(guī)律及檢測方法

蘇貴龍， 李建喜*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050)

摘要由犬瘟熱病毒引起的犬瘟熱(Canine distemper, CD)疾病，是造成犬及部分食肉目動物的一種具有高度傳染性和高死亡率的疾病。犬瘟熱病毒感染犬產(chǎn)生抗體的規(guī)律在臨床上具有非常重要的意義。幼犬在出生后約35 d就失去了母源抗體的保護(hù)，需要人工對其進(jìn)行預(yù)防免疫，以獲得針對該病毒的特異性抗體。犬瘟熱病毒在進(jìn)入機(jī)體后，引起以胸腺依賴性的B2細(xì)胞所介導(dǎo)的體液免疫為主，初次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的IgM稍多于IgG，再次免疫應(yīng)答時記憶性B細(xì)胞發(fā)揮著主要的作用，在很短時間內(nèi)使得特異性IgG抗體達(dá)到較高水平，且在機(jī)體內(nèi)維持很久的時間。通過掌握IgM和IgG抗體產(chǎn)生的量及變化規(guī)律，可以診斷疾病發(fā)生的過程，為疾病的治療和預(yù)防提供診斷依據(jù)。

關(guān)鍵詞犬瘟熱病毒;IgM;IgG;產(chǎn)生規(guī)律;檢測方法

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)，屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，是負(fù)鏈單股不分節(jié)的RNA病毒[1-2]。犬瘟熱病毒(CDV)主要由核衣殼蛋白N、磷蛋白P、基質(zhì)膜蛋白M、融合蛋白F、附著或血凝蛋白H、大蛋白L這6種蛋白組成[3]，其中核衣殼蛋白N、融合蛋白F以及血凝蛋白H是犬免疫系統(tǒng)的主要目的抗原，是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原，核衣殼蛋白N則是保守性較強(qiáng)的免疫原性蛋白。病毒顆粒表面的抗原決定簇，即抗原表位，大多也由N蛋白所決定。H、F、N在犬瘟熱免疫方面起著非常重要的作用[4]。Cherpillod P等[5]研究發(fā)現(xiàn)N蛋白和犬瘟熱病毒CDV的毒力關(guān)系非常密切，犬瘟熱病毒在持續(xù)感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，N蛋白就發(fā)揮著重要的作用。N蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生比較強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。很多的單克隆抗體就是根據(jù)N蛋白生產(chǎn)的[6]。

1犬瘟熱病毒感染犬產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的過程

B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，大致分為2類：一類是不依賴于T細(xì)胞的B1細(xì)胞所介導(dǎo)的，主要針對細(xì)菌的脂多糖和肺炎鏈球菌多糖等抗原，但是機(jī)體內(nèi)發(fā)生的體液免疫應(yīng)答主要以T細(xì)胞依賴性的B2細(xì)胞所介導(dǎo)，犬瘟熱病毒進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生的就是該類型的體液免疫應(yīng)答過程。

犬瘟熱病毒進(jìn)入機(jī)體后，引起的以T細(xì)胞依賴性體液免疫可分為以下階段：識別階段、反應(yīng)階段和效應(yīng)階段。初次應(yīng)答時，抗原進(jìn)入機(jī)體后，樹突狀細(xì)胞等具有加工、遞呈作用的細(xì)胞首先會包裹病毒，并暴露表面的抗原決定簇，然后將暴露出抗原決定簇的病毒交給T細(xì)胞。同時，抗原與B細(xì)胞表面BCR(BCR為B細(xì)胞表面免疫球蛋白)結(jié)合，結(jié)合后釋放第一信號。T細(xì)胞在接受抗原刺激的情況下，會分化為輔助性T細(xì)胞，通過細(xì)胞表面的一些病原相關(guān)模式蛋白及細(xì)胞因子與已經(jīng)結(jié)合抗原的B細(xì)胞接觸，釋放第二信號，與B細(xì)胞發(fā)生相互作用，使得結(jié)合在B細(xì)胞BCR上的抗原最終被活化。此后，B細(xì)胞在生發(fā)中心大量克隆，發(fā)生抗體V區(qū)的親和力選擇，保留親和力強(qiáng)的B細(xì)胞克隆。增殖完成后，B細(xì)胞開始分化，生成漿細(xì)胞，然后在不同細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)下分化成不同的IgE、IgM、IgG等抗體。其中，最先生成分子量大的五聚體IgM。

記憶細(xì)胞的產(chǎn)生：初次免疫應(yīng)答結(jié)束時，很多親和力差的B細(xì)胞就凋亡消失，一些B細(xì)胞在淋巴結(jié)皮質(zhì)區(qū)內(nèi)被抗原和輔助性T細(xì)胞激活而轉(zhuǎn)移至骨髓，但是一些記憶前體細(xì)胞誘導(dǎo)附近T細(xì)胞的CD145分子表達(dá)，促使B細(xì)胞bcl-2分子表達(dá)，bcr-2可保護(hù)B細(xì)胞抵抗凋亡，使得B細(xì)胞分化成記憶細(xì)胞。分化的記憶細(xì)胞表面上有可與IgG結(jié)合的BCR受體，一旦再次接觸抗原，便會分化產(chǎn)生大量抗體，而IgM記憶細(xì)胞的壽命較短，所以再次免疫應(yīng)答主要由IgG記憶細(xì)胞產(chǎn)生漿細(xì)胞為主。同時，那些已經(jīng)擴(kuò)增的B細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞可在MHC-2類分子作用下攝取并加工抗原，然后遞呈給T細(xì)胞，與T細(xì)胞接觸并相互作用，通過粘附分子及抗原遞呈作用被激活并誘導(dǎo)分化[7]。

抗體的類型轉(zhuǎn)化：原始B細(xì)胞結(jié)合了抗原后，在細(xì)胞因子的作用下逐漸生成免疫球蛋白的過程中漿細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白會發(fā)生“類型轉(zhuǎn)化”，即基因的重排，在重排過程中發(fā)生了基因缺失或RNA剪接而產(chǎn)生不同的抗體，缺失不需要的重鏈基因，在不同的細(xì)胞因子的作用下將可變區(qū)與鄰近重鏈恒定區(qū)，即C區(qū)基因通過環(huán)出的方式相聯(lián)接而形成不同的抗體，IgM也可以突變轉(zhuǎn)化生成IgG，但是決定抗原特異性的可變區(qū)，即V區(qū)不發(fā)生變化[8]。

2感染犬瘟熱病毒后犬產(chǎn)生抗體的規(guī)律

犬瘟熱病毒初次刺激機(jī)體時，引起的體液免疫主要在淋巴結(jié)中產(chǎn)生，產(chǎn)生的抗體主要是IgM，其次為IgG，這個時期產(chǎn)生的抗體總量少，且維持時間短，產(chǎn)生抗體的親和力也低，且潛伏期較長。但是，第2次刺激時就會大量產(chǎn)生IgG抗體，其原因是在第1次刺激時已經(jīng)產(chǎn)生了大量的單克隆B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞，當(dāng)這些B細(xì)胞再次與抗原接觸，會在很短的時間內(nèi)與T細(xì)胞發(fā)生作用并被激活，以產(chǎn)生大量的IgG抗體，潛伏期很短，產(chǎn)生抗體的親和力較高，抗體產(chǎn)生后維持時間也較長，總的抗體水平自然也比初次應(yīng)答高很多。更重要的是，在骨髓中的記憶B細(xì)胞在受到抗原刺激時會迅速分化，以產(chǎn)生高親和力、高效價(jià)的抗體。通過初次應(yīng)答與再次應(yīng)答的不同規(guī)律，可以很好地用于疾病診斷等其他臨床用途。

喬貴林等[9]對犬進(jìn)行免疫后，分別在14、28、42 d注射犬瘟熱疫苗，觀察產(chǎn)生抗體的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過3次免疫機(jī)體就可以產(chǎn)生大量的抗體，并維持較長時間。另外，免疫程序和犬的年齡也與抗體的產(chǎn)生量有很大關(guān)系。老年犬因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)的感受性下降，免疫應(yīng)答能力降低。于萬海等[10]對犬分別于首免(6周齡)前1 d、二免(8周齡)前1 d、三免(10周齡)前1 d和三免后前1 d、60 d采血用中和試驗(yàn)(固定病毒-稀釋血清法)檢測仔犬血清CD抗體的中和效價(jià)，進(jìn)行不同劑量抗原刺激，觀察產(chǎn)生的抗體量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的抗原刺激，產(chǎn)生抗體的量也會不同。相徳忠[11]對緊急免疫前后體內(nèi)抗體的變化情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)犬在緊急免疫的情況下體內(nèi)的抗體也呈現(xiàn)低-高-低的變化規(guī)律。

通過酶聯(lián)免疫方法也可以檢測體內(nèi)抗體的變化，了解抗體在機(jī)體內(nèi)的變化規(guī)律。Von Messling V等[12]以抗N蛋白單克隆抗體捕獲重組桿狀病毒表達(dá)的CDV的N蛋白作為抗原，建立了夾心ELISA的方法，用以檢測犬血清中的CDV特異性抗體。這種方法與血清中和試驗(yàn)及RT-PCR試驗(yàn)相比有著較高的靈敏性和特異性，可用于對犬血清中抗體的檢測，方便對抗體在犬體內(nèi)的變化過程進(jìn)行檢測[12]。

3檢測IgM和IgG抗體的實(shí)驗(yàn)室方法

臨床實(shí)驗(yàn)室檢測抗體的方法有很多，如中和試驗(yàn)和間接免疫酶染色法等[13]。其中，IgM采用酶聯(lián)免疫捕獲法、IgG采用間接法，能夠比較準(zhǔn)確反映體內(nèi)抗體水平。捕獲法測量IgM時，固相包被抗IgM抗體，然后將待測抗體加入，發(fā)生特異性地結(jié)合，再加入與IgM特異性反應(yīng)的抗原、酶標(biāo)抗體后加底物顯色。采用間接法[14]測量IgG時，包埋物是能與IgG特異性反應(yīng)的抗原，IgG與抗原結(jié)合后再加入酶標(biāo)抗抗體、底物顯色，就可以檢測IgG。測量IgM時不用間接法的原因是特異性和非特異性IgG的吸附能力都很強(qiáng)，可以與抗原結(jié)合；而捕獲法就可以避免這種情況，避免了假陰性的出現(xiàn)。

王琛[15]用ELISA檢測犬五聯(lián)苗高免血清中CDV抗體水平，以CDV的N蛋白為抗原，兔抗犬IgG為二抗，旨在證實(shí)將CDV的N蛋白導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)后的蛋白可用于CDV的檢測。對各環(huán)節(jié)在不同條件下的篩選進(jìn)行比較試驗(yàn)，得到最佳條件：試驗(yàn)將純化的CDV的N蛋白包被在1 μg/孔的酶標(biāo)板，溫度為4 ℃，過夜，用 10%兔血清進(jìn)行封閉，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為 1∶8 000 倍稀釋，37 ℃條件下反應(yīng)1 h。研究發(fā)現(xiàn)，CDV的N 蛋白檢測 CDV 抗體時具有較高的特異性和靈敏度、抗原易純化、重復(fù)性好等特點(diǎn)。

4犬瘟熱抗體檢測的臨床意義

4.1預(yù)防免疫目前，預(yù)防犬瘟熱病毒的辦法主要有弱毒疫苗或者油乳劑滅活疫苗，采用疫苗免疫預(yù)防可以取得顯著的成效[16]。研究發(fā)現(xiàn)，CDV母源抗體的半衰期為8.5 d。研究表明，幼犬母源性的IgG半衰期大約為8 d，貓為4.4 d[17]。

幼犬在出生后，需要一段時間才能健全其免疫系統(tǒng)，并且通過胎盤攜帶的母源抗體非常少，僅僅為3%的IgG抗體，它是唯一能通過胎盤的抗體，盡管IgG和IgM主要是在淋巴結(jié)和脾臟中產(chǎn)生，可是由于IgM為五聚體，分子量較大，不可以通過胎盤屏障。從開始吃母乳起，抗體滴度先有所升高，到6～8周滴度如果低于1∶20以下，則犬就極其容易感染犬瘟熱病毒(CDV)，就需要及時進(jìn)行免疫。但是，也不能過早地進(jìn)行免疫，否則會因?yàn)槟冈纯贵w的存在，導(dǎo)致免疫失敗。Heddle等[18]測定了母犬初乳及常奶(產(chǎn)后25～50 d)中免疫球蛋白成分的含量，并與血清中的含量進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)初乳中IgG抗體為血清中平均數(shù)的160%，而IgM較少，僅為14%。

臨床上，對犬免疫程序也是根據(jù)抗體產(chǎn)生規(guī)律而制定的。體液免疫的初次應(yīng)答和再次應(yīng)答，是大量產(chǎn)生的B細(xì)胞以及產(chǎn)生抗體、發(fā)揮免疫作用的過程。初次免疫產(chǎn)生的抗體量較少，且特異性抗感染的IgG量少，需要進(jìn)行第2次免疫，以產(chǎn)生較多的特異性抗體。記憶應(yīng)答主要是記憶細(xì)胞快速大量分化、克隆擴(kuò)增并產(chǎn)生抗體的過程。實(shí)施第3次免疫就可以發(fā)揮記憶細(xì)胞的作用，少量抗原的刺激即可將抗體維持在較高的水平，并且可以維持1年左右的時間。此外，也不能在短時間內(nèi)連續(xù)免疫，以免免疫失敗，從而影響了免疫效果。

表1　IgM和IgG臨床檢查用于疾病的診斷

李秋波等[19]以首次免疫后每隔20 d再免疫，觀察抗體的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)行3次免疫可以保證抗體的量維持較長時間。對于沒有吃過母乳的幼犬，應(yīng)盡早進(jìn)行免疫。

4.2疾病診斷臨床上，檢測IgM、IgG具有非常重要的意義。由表1可知，根據(jù)IgM和IgG產(chǎn)生陽性及陰性的不同，可以用于疾病的診斷。其中，IgM對疾病的早期診斷具有非常重要的作用。另外，當(dāng)胎兒臍帶中檢測到IgM時，表示有宮內(nèi)感染。

5小結(jié)

犬瘟熱病毒感染犬在臨床上嚴(yán)重影響犬的健康，因此掌握犬瘟熱病毒刺激犬產(chǎn)生抗體的規(guī)律對控制疾病的發(fā)生、及時診斷疾病等具有非常重要的臨床意義。同時，犬瘟熱單克隆抗體在臨床上有重要的應(yīng)用。比如，膠體金法檢測CDV[20]采用的就是CDV制備的單克隆抗體，待測抗原通過與包埋的抗體結(jié)合，然后與另一個指示抗原結(jié)合，檢測線T顯色。質(zhì)控線C為二抗，可以直接與包埋的抗體結(jié)合。層析技術(shù)在膠體金中的運(yùn)用，使得待測物質(zhì)和包埋的抗體均會流動至T線和C線，這樣C線始終都可以顯色，如果不顯色則說明不能再使用該試紙條[21]，此方法操作簡便，在臨床上有廣泛應(yīng)用。

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中圖分類號S852.65+5文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611(2015)30-116-03

基金項(xiàng)目公益性行業(yè)專項(xiàng)(201303040-15)。

作者簡介蘇貴龍(1988- )，男，甘肅平?jīng)鋈耍T士研究生，研究方向：中獸醫(yī)免疫與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事中獸醫(yī)免疫與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)研究。

收稿日期2015-09-07

The Rule of Canine Distemper Virus (CDV) Stimulate Dogs to Produce Antibodies and Its Detection Method

SU Gui-long, LI Jian-xi*(Lanzhou Institute of Animal Science and Veterinary Pharmaceutics of CAAS, Lanzhou, Gansu 730050)

AbstractCanine distemper, caused by canine distemper virus, is a disease that causes carnivore animals highly contagious and high mortality. Puppies lost the protection of the maternal antibody after being borned in about 35 days. By that time, the artificial immune to their prevention is needed, so that they can obtain the specific antibodies against the virus. After the canine distemper virus enters the body, the humoral immunity mediated by the thymus dependent B2 cells is caused. For the first time of the immune response, IgM is produced slightly more than IgG. For the second time of the immune response, memory B cells play a major role, it makes specific IgG antibody achieve a higher level and maintain longer in a short time. The disease process can be diagnosed by grasping the amount of IgM and IgG and its change rule, which provides the diagnosis basis for the treatment and prevention of the disease.

Key wordsCanine distemper virus; IgM; IgG; Occurrence law; Detection method