李 合 ，王人衛(wèi) ，趙 璨 ，王超宇 ，劉曉麗 ，洪潤肖

運動性月經(jīng)周期紊亂是女性特殊的醫(yī)學問題，對女性的身心健康均有不利影響。調查研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀長跑運動員的運動性閉經(jīng)的發(fā)病率高達40%～50%[1]，大學生運動員運動性閉經(jīng)的發(fā)病率也高達31%[2]，參與休閑體育活動的女性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生率也普遍偏高，而普通女性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生率僅為2%～5%[3]。運動性月經(jīng)周期紊亂起始于下丘腦功能紊亂，其促性腺激素釋放激素（GnRH）脈沖性釋放的情況直接關系到性腺軸調節(jié)的正常與否。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦GnRH脈沖性釋放與瘦素（leptin）密切相關，下丘腦GnRH脈沖的釋放需葡萄糖氧化供能，葡萄糖進入下丘腦是依賴于leptin的介導[4-6]，當leptin水平較低時，下丘腦就因無足夠的葡萄糖供能而引起GnRH釋放失調。大負荷運動的女性和能量攝入受到限制或不足的女性，血液中l(wèi)eptin的濃度均降低。

近年越來越多的動物和人類模型的研究資料都支持能量攝入不足而導致慢性能量負平衡[7]。但是，有關增加外源性可利用能量對leptin水平影響的研究卻鮮有報道。因此，本研究在不改變大鼠運動負荷、不使用藥物干預的情況下，參照王人衛(wèi)等建立動情周期 （又名發(fā)情周期，是雌性哺乳類動物擁有的一種生理性變化，類似人類月經(jīng)周期）抑制模型的方法[8]，即表現(xiàn)為陰道脫落細胞中、底層有核上皮細胞增多。通過6周的遞增負荷訓練建立動情周期抑制模型后，再進行3周恒定負荷訓練（以維持動情周期抑制狀態(tài)），同時采取不同的干預措施。觀察在僅以補糖方式提供外源性可利用能量的情況下，動情周期抑制大鼠的動情周期恢復和血清leptin水平的改變情況，探討能否通過補充外源性能量改善leptin水平，進而促進動情周期抑制的緩解，并進一步分析哪種補糖效果較好。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取健康成熟2月齡雌性SD大鼠45只，由上海實驗動物資源中心西普爾—必凱實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號是SCXK（滬）2008-0016，利用符合國家飼料衛(wèi)生標準的嚙齒類動物飼料 （由上海仕林生物科技有限公司提供，產(chǎn)品標準編號：Q/TJCX 1-2007），作為基礎標準飼料（1337KJ/100g）。干預所用的葡萄糖和低聚糖由河北華辰淀粉糖有限公司提供，生產(chǎn)許可證號是QS130123010057，質量管理體系認證證書編號為：00109Q23299R0M/1300。大鼠隨機分籠，每籠3只，自由飲食和飲水。室溫20～25℃，相對濕度55%～60%，每天光照12 h，從上午9:00至晚上21:00。本實驗設計通過上海市營養(yǎng)學會醫(yī)學倫理委員會的鑒定并接受其監(jiān)督 （上海市營養(yǎng)學會醫(yī)學倫理委員會 [倫審]2013-002）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組方法

45只2月齡SD雌性大鼠在適應運動兩周后，隨機分為5組，每組9只。分為對照組C組，該組不進行運動訓練；模型中組M組，該組進行9周運動訓練，前6周為遞增負荷訓練，后3周為恒定負荷訓練。實驗干預組分為3組，前6周為遞增負荷訓練，后3周采取不同的干預方式，其中后3周安靜休息的為R組；繼續(xù)進行3周恒定負荷訓練，并進行葡萄糖補充的為G組；繼續(xù)進行3周恒定負荷訓練，并進行低聚糖補充的為O組（見圖1）。實驗組的運動負荷方案同陽性對照組M組一致，后3周的恒定負荷采用的是第6周遞增負荷訓練的方案。

圖1 實驗設計Figure1 Experiment Design

1.2.2 干預方法

本實驗模擬田徑運動中周期性耐力跑的形式，參照Bedford動物運動負荷標準[9]。每周訓練6 d，休息 1 d，每天訓練兩次，上下午各訓練一次，第9周最后一天晚上再加訓一次。在大鼠處死前安靜休息36 h，以消除運動應激產(chǎn)生的影響，并禁食12 h。

對照組和實驗組前6周均采用普食喂養(yǎng)，且均飲用純凈水；后3周實驗組的G組和O組在普食喂養(yǎng)的基礎上，每天稱取 24 g葡萄糖（17.2 kJ/g）或低聚糖(17.2 kJ/g)，溶于200 ml溫水中，攪拌溶解后，供大鼠飲用，其余組仍飲用純凈水和普食喂養(yǎng)。

1.2.3 取材

大鼠稱重后，按40 mg/kg大鼠體重計算麻醉劑 （濃度10%水合氯醛）量，5min大鼠麻醉后，測量大鼠體長。將大鼠四肢固定在手術臺上，迅速打開腹腔，剝離下腔靜脈，用一次性負壓真空管采血5～8 ml后，取出腹壁、腎周圍及生殖器周圍脂肪等內(nèi)臟器官處的白色脂肪組織，并利用FA-2004型電子天平稱重并進行記錄。血液樣本在低溫離心（3000r/min）15 min后，取上清液測定雌激素、孕酮和瘦素。

1.2.4 指標檢測

雌二醇（E2）的測定使用免疫化學發(fā)光法，采用Beckman Coulter公司生產(chǎn)的 Access 2 immunoassay system （全自動化學發(fā)光免疫測定系統(tǒng)）測定，試劑盒由Beckman Coulter公司提供。孕酮（P）的測定使用雙抗體放射免疫分析法，γ記數(shù)儀采用中科院上海原子能所日環(huán)儀器廠所生產(chǎn)的（型號為SN695B型智能型）；孵育箱采用的是青島海爾公司生產(chǎn)的；移液器采用法國吉爾森Gilson公司生產(chǎn)的。瘦素（Leptin）的測定采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），采用 Thermo生產(chǎn)的酶標儀測定（型號為MK3），試劑盒由美國R&D公司提供。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用spss20.0數(shù)據(jù)軟件包對數(shù)據(jù)進行分析處理，所得結果均以均值±標準差表示。組間差異采用單因變量方差分析進行分析，兩兩比較采用Tukey法分析。P<0.05，具有顯著性差異。

2 研究結果

2.1 體重及內(nèi)臟脂肪含量的變化

由表1可見，各組大鼠體重在6周遞增運動負荷未采取恢復措施前，體重變化基本同C組一致，但自第七周開始，不同組別體重的變化趨勢開始不同，R組體重自第七周開始迅速增長，M組體重基本不再變化，而O、G組也呈增長趨勢，但無R組明顯。

各組大鼠實驗前體重無顯著性差異（表2），但經(jīng)過運動訓練和不同干預措施后，實驗結束后體重有顯著性差異。干預組中，除R組顯著高于C組外，G組和O組均顯著低于C組；而干預組各組均顯著高于M組。干預組各組間比較發(fā)現(xiàn)，R組均顯著高G組和O組，而G組和O組間無顯著性差異。

將大鼠體長、體重作為隨機變量，利用協(xié)方差統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（表3），M組的內(nèi)臟脂肪含量顯著低于陰性對照組C組。而經(jīng)過3周的干預，實驗干預組各組的內(nèi)臟脂肪含量均顯著高于M組，且R組的內(nèi)臟脂肪含量同C組相比較，無統(tǒng)計學差異；G組的內(nèi)臟脂肪含量同O組也無統(tǒng)計學差異。

2.2 血清leptin濃度的變化

表4為大鼠血清leptin濃度的變化，由表可見，M組的血清leptin濃度顯著低于其余4組。O組的血清leptin濃度顯著低于C組，而R組和G組的血清leptin濃度同C組無顯著性差異。O組、R組和G組之間血清leptin濃度無顯著性差異。

表4 各組大鼠血清leptin濃度的變化情況 (單位：μg/L)Table Ⅳ Serum Leptin Concentration Changes of the Different Group Rats(ug/L)

2.3 雌激素和孕激素的變化

由表5可見，各組大鼠血清E2存在顯著性差異。同C組相比較，只有M組大鼠血清E2濃度顯著低于C組,而其余組與C組相比，均無顯著性差異。R組和O組大鼠血清E2濃度顯著高于M組，而G組血清E2濃度與M組相比無顯著性差異。R組、O組及G組之間大鼠血清E2濃度無顯著性差異。

表5 各組大鼠血清E2濃度的變化情況 (單位：pg/ml)Table Ⅴ Serum E2Concentration Changes of the Different Group Rats(pg/ml)

由表6可見，各組大鼠血清P濃度存在顯著性差異。M組的血清P濃度顯著低于其余4組，而其余4組之間并無顯著性差異。

表6 各組大鼠血清P濃度的變化情況（單位：pg/ml）Table Ⅵ Serum P Concentration Changes of the Different Group Rats(pg/ml)

3 討論與分析

內(nèi)臟脂肪具有緩沖震蕩、保護內(nèi)臟器官，又具有提供能量、維持機體生命需要的作用。在外源性能量不足以維持運動和基本生理消耗時，內(nèi)臟脂肪則成為主要的供能物質。研究發(fā)現(xiàn)，運動性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生的主要原因在于機體可利用能量的不足[10]，作為機體能量的存儲器，內(nèi)臟脂肪對維持月經(jīng)周期正常具有重要作用。研究報道，普通大學生內(nèi)臟脂肪含量高于體育專業(yè)女生含量，而體育專業(yè)女生月經(jīng)失調的比例遠高于普通大學生[11]。女性運動員在長期可利用能量不足的情況下，機體動員內(nèi)臟脂肪分解，導致內(nèi)臟脂肪含量下降，運動性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生比例升高。由本研究可見，通過安靜休息、補充低聚糖或葡萄糖，均減少了內(nèi)臟脂肪的消耗。

近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪除上述功能外，還能夠以自分泌、旁分泌、遠距分泌的方式產(chǎn)生生物活性因子，具有免疫、調節(jié)機體能量平衡、影響生殖功能等作用。因此，內(nèi)臟脂肪不僅具有儲存能量作用，也有“內(nèi)分泌器官”的分泌功能。leptin是由脂肪細胞分泌的一種多肽類激素，與其受體結合后，具有抑制食欲、減少能量攝入、增加能量消耗等多種生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠腦室注射leptin后減少了食物的攝取，導致體重的下降，表明leptin能直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的leptin受體，傳達給中樞神經(jīng)系統(tǒng)機體能量儲存信號[12-14]。人在進入青春期后，血清中l(wèi)eptin的水平顯著升高，并且女性的leptin水平通常是男生的2～3倍[15]。離體的實驗研究表明，leptin能夠直接作用于下丘腦和腦垂體，刺激GnRH和LH的釋放[16]。循環(huán)血液中l(wèi)eptin水平通常與體內(nèi)儲存的脂肪量保持在一定比例，一定量的leptin進入大腦，通過與下丘腦內(nèi)的leptin受體結合控制食物的攝取和能量的消耗[4]。循環(huán)血清中的leptin水平反映了脂肪儲存的能量以及在能量攝入時的急劇變化[16]，進行劇烈運動的大鼠和能量攝入受到限制或不足的女性，循環(huán)血液中的leptin水平減少并伴有內(nèi)分泌異常，對性腺軸和甲狀腺軸有較大的影響。下丘腦GnRH脈沖性釋放與leptin密切相關，研究發(fā)現(xiàn)下丘腦GnRH脈沖的釋放需葡萄糖氧化供能，葡萄糖進入下丘腦是依賴于leptin的介導[4]，所以當leptin水平較低時，下丘腦因無足夠的葡糖糖供能而引起GnRH釋放的紊亂。因此，當內(nèi)臟脂肪過度消耗時，leptin的分泌受到影響，直接影響哺乳動物的生殖功能[17]，導致閉經(jīng)的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組的leptin水平顯著低于對照組。采用安靜休息、補充低聚糖和葡萄糖等干預措施組的lep tin水平均較模型組顯著升高，表明通過安靜休息或補糖干預，能有效減緩leptin水平下降。同時，伴隨血清leptin濃度的升高，安靜休息組、補充低聚糖組和補充葡萄糖組大鼠的血清E2、P濃度也升高，表明大鼠動情周期抑制逐步緩解。

4 結論

通過對動情周期抑制大鼠補充葡萄糖或低聚糖，增加了內(nèi)臟脂肪含量，促進了瘦素的分泌和雌激素、孕激素的合成，有效緩解大鼠的動情周期抑制。補充兩種糖之間的效果無顯著性差異。

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