·基礎(chǔ)研究·

水平振搖在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提純中的作用

王偉恒，鄧國(guó)英，徐立璋，程自申，楊向群，葉曉健

作者單位：200003上海， 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院骨科

通信作者：葉曉健yexj2002@163.com

【摘要】目的研究水平振搖對(duì)全骨髓貼壁分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量、純度、凋亡及遠(yuǎn)期增殖及分化能力的影響，探索更為簡(jiǎn)單、高效的間充質(zhì)干細(xì)胞提純方法。 方法在全骨髓貼壁法的基礎(chǔ)上，使用水平搖床，以180 r/min、4 h為干預(yù)條件，水平振搖后計(jì)算貼壁細(xì)胞總數(shù)量；使用流式細(xì)胞儀測(cè)定貼壁細(xì)胞純度及凋亡情況；使用MTT法測(cè)定振搖后貼壁細(xì)胞24 h的增殖情況；對(duì)分離純化后細(xì)胞使用定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。結(jié)果經(jīng)振搖處理后，獲得的細(xì)胞總量有所下降，細(xì)胞純度顯著提升，凋亡略有增加，增殖情況變化不大，具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。結(jié)論水平振搖法可顯著提高全骨髓貼壁法的提純效率，具有推廣價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】大鼠; 骨髓; 間質(zhì)干細(xì)胞; 分離和提純;

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA032203)

作者簡(jiǎn)介：王偉恒(1989— )， 碩士在讀，醫(yī)師

【中圖分類號(hào)】R 329.28 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A

DOI【】

收稿日期：(2014-10-12)

Exploration of horizontal shaking for bone marrow mesenchymal stem cells purificationWANGWei-hang,DENGGuo-ying,XULi-zhang,CHENGZi-shen,YANGXiang-qun,YEXiao-jian.DepartmentofOrthopaedics,ChangzhengHospital,SecondaryMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of horizontal shaking on cell purity, activity, apoptosis, and differentiation in the process of the in vitro isolation and purification of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Even the shaking effect for the cells proliferation, differentiation ability in the future. To establish a simpler and more efficient method for BMSCs purification. Methods Based on the whole bone marrow adhesion method, BMSCs isolated and purified by using different attachment method and shaking treatment of 180 r/min for 4 h, and then analyzed the adherent cell state including cell counting by cells counter; cell purity and apoptosis by flow cytometry; cells proliferation after shaking 24 h by MTT method; cells differentiation by directional induction medium. ResultsAfter shaking, cell count was decrease, purity was increased, apoptosis was increased, proliferation had no change, and the harvested cells had the ability to differentiate into osteoblasts and adipocytes. ConclusionThe whole bone marrow adhesion method combined with appropriate shaking is more efficient and worth popularizing.

【Key words】Rats; Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Isolation & purification;

J Spinal Surg, 2015,13(1):45-49

近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)作為種子細(xì)胞在脊髓損傷[1-3]、椎間盤(pán)退變[4-6]和纖維環(huán)修復(fù)[7-8]等脊柱外科領(lǐng)域備受關(guān)注。但因其在骨髓中含量低，體外培養(yǎng)易分化和老化[9],獲得足夠數(shù)量的高純度、高活性、低分化的間充質(zhì)干細(xì)胞是進(jìn)行相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。

目前從骨髓中提純BMSCs方法主要包括：全骨髓貼壁法[10]、密度梯度離心法[11]、流式細(xì)胞儀分離法[12]、免疫磁珠分離法[13]。全骨髓貼壁法是根據(jù)細(xì)胞貼壁能力的差異篩選間充質(zhì)干細(xì)胞，此法簡(jiǎn)單易行，但得到的細(xì)胞純度較低。密度梯度離心法操作繁復(fù)，提取細(xì)胞純度較高，但生長(zhǎng)緩慢活性低，原代細(xì)胞首次融合時(shí)間長(zhǎng)[14]。流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠分離法是利用特異性抗體篩選BMSCs，提取效率較高，但對(duì)細(xì)胞正常生理有影響，且成本高難以普及[12-13]。因此尋找一種簡(jiǎn)單高效的提取方法，對(duì)BMSCs的推廣研究具有特殊意義。

從骨髓中分離純化的間充質(zhì)干細(xì)胞主要混有成纖維細(xì)胞和造血系細(xì)胞。在這幾種細(xì)胞中成纖維細(xì)胞的貼壁能力最強(qiáng)，BMSCs次之，造血系細(xì)胞較弱[10]。本研究借鑒小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的分離純化方法[15]，在全骨髓貼壁法的基礎(chǔ)上利用水平振搖對(duì)BMSCs進(jìn)行分離純化。研究機(jī)械振搖在純化BMSCs中的作用以及對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響，最終簡(jiǎn)便而高效的從大鼠骨髓中成功分離培養(yǎng)出高純度的BMSCs，并將其誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。

1材料和方法

1.1試劑和儀器

清潔級(jí)SD大鼠(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不限，體重(100±10) g；5 mL一次性注射器，DMED-F12培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，胎牛血清(Gibco，美國(guó))，T75培養(yǎng)瓶(corning，美國(guó))，大培養(yǎng)皿(corning，美國(guó))，三抗(Gbico，美國(guó))，無(wú)EDTA 0.25%胰酶(GIBCO)，BMSC成骨成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(Cyagen,美國(guó))，CD45,CD31,CD90,CD29 流式分析抗體及同型對(duì)照(BD，美國(guó))，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD，美國(guó))，MTT增殖活性試劑盒(碧云天，中國(guó))。

1.2BMSCs原代細(xì)胞的獲取

根據(jù)文獻(xiàn)[10, 20]中報(bào)道方法并適當(dāng)改良 ，取12只SD大鼠CO2窒息處死后，置于75%酒精中浸泡10 min，于無(wú)菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，剪除兩端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM培養(yǎng)液從長(zhǎng)骨一端反復(fù)沖洗骨髓腔，離心后以完全培養(yǎng)基(10%FBS，DF-12，1%三抗)重懸。收集細(xì)胞懸液，以約平均2只/瓶的細(xì)胞總量，10 mL的培液體積，接種于6個(gè)T75培養(yǎng)瓶中。于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。24 h后換液，之后隔日換液。1周后可觀察到集落明顯形成，為實(shí)驗(yàn)所用對(duì)象。每次實(shí)驗(yàn)振搖前30 min更換培養(yǎng)液。

1.3實(shí)驗(yàn)方法/干預(yù)

取6瓶同批次BMSCs原代細(xì)胞，隨機(jī)分為2組，每組各3瓶。一組于37℃水平搖床180 r/min振搖4 h(實(shí)驗(yàn)組)，另一組不加處理(對(duì)照組)。振搖結(jié)束后棄上清，消化貼壁細(xì)胞后計(jì)數(shù)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)胞CD45、CD31、CD90、CD29的表達(dá)情況，同時(shí)進(jìn)行AnnexinⅤ-fitc+PI標(biāo)記的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。貼壁消化的細(xì)胞重新種于96孔板，24 h后MMT法測(cè)定貼壁細(xì)胞傳代后的增殖活性，另一批種于24孔板中進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)分化。

使用Counterstar全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)處理前后貼壁細(xì)胞總數(shù)量。

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定BMSCs純度：相同條件下使用37℃、0.25%的胰酶將細(xì)胞消化后移至離心管內(nèi)，以150×g(g=9.806 65 m/s2)離心，5 min后棄上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞準(zhǔn)備，加入抗體及同型對(duì)照，染色15 min后，經(jīng)PBS稀釋至500 μL，由流式細(xì)胞儀(FAC500)進(jìn)行貼壁細(xì)胞CD29、CD90、CD45、CD31陽(yáng)性率檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞純度，鑒定振搖的分離純化效果。

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定BMSCs凋亡：取同批次細(xì)胞，經(jīng)上述消化離心調(diào)整密度后，取剩余細(xì)胞，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)染色后，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)[21-22]。測(cè)定貼壁細(xì)胞凋亡率，評(píng)估貼壁細(xì)胞的凋亡情況。

MMT法測(cè)定振搖后細(xì)胞活性：將處理后與不處理的貼壁細(xì)胞消化后，以1×104/mL的細(xì)胞密度，每孔100 μL種于96孔板內(nèi)，每瓶種3個(gè)孔，每組9個(gè)孔，20 h貼壁后，按照文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法檢測(cè)細(xì)胞活性，評(píng)估振搖處理對(duì)細(xì)胞后續(xù)增殖能力的影響。

體外分化潛能測(cè)定：經(jīng)純度鑒定后，選取純度最高組以細(xì)胞密度1×105/mL，每孔1 mL接種于24孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后分別加入成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每3 d換液，3周后經(jīng)4%多聚甲醛固定后分別以茜素紅和油紅O染色[23]，鏡下觀察分化指標(biāo)。以茜素紅染色后骨結(jié)節(jié)的形成和油紅O染色后脂滴的形成來(lái)評(píng)價(jià)成骨成脂分化能力，評(píng)估振搖后的細(xì)胞分化潛能。

所有染色過(guò)程均按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，染色后1 h內(nèi)檢測(cè)拍照完畢。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得到的數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件(美國(guó)IBM公司)進(jìn)行分析和處理，使用單因素方差分析法，進(jìn)行2組間的比較。設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1振搖后貼壁細(xì)胞量及純度的結(jié)果

與對(duì)照組相比,水平振搖處理后，貼壁細(xì)胞的數(shù)量約下降1/3(見(jiàn)圖1a)，細(xì)胞CD29和CD90 2項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性率均顯著上升，振搖后貼壁細(xì)胞的純度大幅提升(見(jiàn)圖1b-f)。CD45和CD31 2個(gè)陰性指標(biāo)陽(yáng)性率均<1%，對(duì)結(jié)果分析影響不大，故未在圖中顯示。

2.2振搖后貼壁細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀結(jié)果分析顯示振搖刺激可使貼壁細(xì)胞凋亡增加。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)，但在目前的干預(yù)條件下，凋亡水平均較低，振搖后凋亡率升高幅度不大(見(jiàn)圖2)。

a: 2組貼壁細(xì)胞量b: 對(duì)照組貼壁細(xì)胞CD29陽(yáng)性率c: 實(shí)驗(yàn)組組貼壁細(xì)胞CD29陽(yáng)性率d: 對(duì)照組貼壁細(xì)胞CD90陽(yáng)性率e: 實(shí)驗(yàn)組組貼壁細(xì)胞CD90陽(yáng)性率f: 2組貼壁細(xì)胞純度

a: Number of adherent cells of 2 groupsb: Control group CD29 positive rate of adherent cellsc: Experiment group CD29 positive rate of adherent cellsd: Control group CD90 positive rate of adherent cellse: Experiment group CD90 positive rate of adherent cellsf: Purity of adherent cells of 2 groups

圖12組貼壁細(xì)胞量及細(xì)胞純度

Fig.1Number and purity of adherent cells of 2 groups

表12組貼壁細(xì)胞的凋亡率

Tab.1Apoptosis rate for adherent cells of 2 gruoups

組別Groups早期凋亡Earlyapoptosis晚期凋亡Lateapoptosis總凋亡Totalapoptosis對(duì)照組Controlgroup1.13±0.214.53±0.705.67±0.76實(shí)驗(yàn)組Experimentgroup1.53±0.617.23±0.72*8.77±0.21*

注：早期凋亡不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；*晚期凋亡和總凋亡率明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

Note：Early apoptosis was not obvious, difference has no statistically significant (P>0.05); *Late apoptosis and total apoptosis was obvious, difference has statistically significant (P<0.05)

a： 對(duì)照組b: 實(shí)驗(yàn)組

a: Control groupb： Experiment group

圖22組貼壁細(xì)胞凋亡率

Fig.2Apoptosis of adherent cells of 2 groups

圖3成骨誘導(dǎo)3周后茜素紅染色情況(×400)

Fig.3Alizarin red staining after osteogenic induction 3 weeks(×400)

圖4成脂誘導(dǎo)3周后油紅O染色情況(×400)

Fig.4Red O staining after adipogenic induction 3 weeks(×400)

2.3振搖24 h后MTT檢測(cè)貼壁細(xì)胞增值能力

MTT檢測(cè)顯示振搖前后貼壁細(xì)胞均形成藍(lán)紫色結(jié)晶,全自動(dòng)酶標(biāo)儀顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比色結(jié)果分別為0.299±0.013 82和0.304±0.025 17。2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。振搖對(duì)貼壁細(xì)胞的增值能力影響并不顯著。

2.4振搖后貼壁細(xì)胞成骨成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果

用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)振搖處理后的貼壁細(xì)胞行誘導(dǎo)分化，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，茜素紅染色顯示細(xì)胞外基質(zhì)中有鈣結(jié)節(jié)形成(見(jiàn)圖3)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d左右可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)有所改變并隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中脂滴變大，誘導(dǎo)3周時(shí)油紅O染色結(jié)果顯示多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)紅色脂滴(見(jiàn)圖4)。

3討論

雖然在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作中實(shí)驗(yàn)人員采取了多種改進(jìn)方法，但由于原代細(xì)胞提取本身的局限性，批次之間、各培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞量之間的差異不可避免，最終結(jié)果，批次間和培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞略有不同，但在實(shí)驗(yàn)干預(yù)前后均出現(xiàn)穩(wěn)定顯著差異，說(shuō)明水平震搖的純化效果。在實(shí)驗(yàn)操作中，原代細(xì)胞提取時(shí)統(tǒng)一重懸后平均接種于各培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞差異不大。但大批量操作時(shí)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的可控性降低，故同一批次實(shí)驗(yàn)時(shí)使用大鼠數(shù)量定為12只，平均分為2組，每組均勻接種與3個(gè)培養(yǎng)瓶，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間段內(nèi)重復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證。另外，因過(guò)高的細(xì)胞密度可導(dǎo)致干細(xì)胞分化[16-17]，因此選擇1周為時(shí)間節(jié)點(diǎn)以控制不同批次間細(xì)胞量的差異。即便如此，因批次之間基線不盡相同，不宜同時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，振搖分離方法穩(wěn)定性佳，振搖前后差異顯著，故本研究所展示為其中1組數(shù)據(jù)。而同一批次內(nèi)，瓶與瓶之間在細(xì)胞狀態(tài)上不盡相同，雖經(jīng)過(guò)重懸和平均分配，同組內(nèi)不同培養(yǎng)瓶間差異仍無(wú)法完全避免，但因差異較小而未做進(jìn)一步處理。

4個(gè)抗體的選擇上[18]，CD29和CD90 陽(yáng)性指標(biāo)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中敏感性強(qiáng)，但CD45和CD31 陰性指標(biāo)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中皆處于極低水平，敏感性差，故未做處理分析。被搖晃下來(lái)的大量細(xì)胞因成分復(fù)雜，需要試驗(yàn)性使用多種抗體進(jìn)行鑒定，不屬于此次研究的重點(diǎn)，且不影響B(tài)MSCs純化結(jié)果的可靠性，因此未做鑒定。

參照小膠質(zhì)細(xì)胞的分離方法，本研究選擇180 r/min、4 h作為干預(yù)條件[19]，明確證明通過(guò)物理刺激，即振搖法分離純化細(xì)胞的可行性。整體而言，在BMSCs的純化中，水平振搖法可引起培養(yǎng)液運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生對(duì)貼壁細(xì)胞的流體剪切力[20]，這對(duì)有較強(qiáng)貼壁能力的BMSCs的提純有顯著的優(yōu)化作用[21]，從而實(shí)現(xiàn)不同貼壁能力細(xì)胞的分離。這也是經(jīng)典的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分離的理論依據(jù)[19]。全骨髓貼壁法中，細(xì)胞分為造血系細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，其中造血系的細(xì)胞貼壁能力較差而B(niǎo)MSCs貼壁能力較強(qiáng)[10]。因此，參照小膠質(zhì)細(xì)胞和突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的分離方法進(jìn)行BMSCs分離純化理論上是可行的。

從細(xì)胞的凋亡上看，貼壁細(xì)胞在流體剪切力作用下不斷凋亡、不斷脫壁，在不同的階段維持相對(duì)穩(wěn)定的凋亡比例[22]。凋亡細(xì)胞的貼壁能力較低，較易脫壁，在較高振搖頻率下導(dǎo)致更易脫壁。從細(xì)胞總數(shù)量來(lái)看，雖然有接近1/3的細(xì)胞脫壁，但貼壁細(xì)胞中總凋亡率只有9%左右，因此在180 r/min，4 h水平振搖的條件下對(duì)于細(xì)胞的純化作用應(yīng)遠(yuǎn)大于其所造成的細(xì)胞損傷。

從分離后細(xì)胞活性看，水平振搖對(duì)貼壁細(xì)胞的活性影響并不顯著，但可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞純度的顯著增高，細(xì)胞純度的增高可能更利于細(xì)胞的增殖活性。因此本方法具有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

在混合培養(yǎng)體系中，一種細(xì)胞的純度增加可表現(xiàn)為該細(xì)胞分裂能力突出引起的“絕對(duì)”純度增加和雜細(xì)胞數(shù)量降低引起的“相對(duì)”純度增加。物理方法純化細(xì)胞的機(jī)制可能是：細(xì)胞本身貼壁能力的差異導(dǎo)致直接分離；細(xì)胞對(duì)物理刺激抵抗能力的差異引起細(xì)胞不同程度的繼發(fā)凋亡，而凋亡后細(xì)胞的貼壁能力降低導(dǎo)致不同程度的間接分離。BMSCs細(xì)胞因其相對(duì)較強(qiáng)的貼壁能力和抵抗物理刺激的能力，在水平振搖后得到純化。而造血系細(xì)胞則因貼壁能力較差在振搖的過(guò)程中直接脫壁，或是因其對(duì)物理刺激的抵抗能力較弱而產(chǎn)生凋亡后貼壁能力減弱而脫壁。最終達(dá)到純化BMSCs的作用。

綜上所述，全骨髓貼壁法提取BMSCs經(jīng)過(guò)水平振搖處理后得到的貼壁細(xì)胞，細(xì)胞純度得到顯著提升，且由振搖所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡較輕，對(duì)后續(xù)細(xì)胞增殖分化能力影響不明顯。因此，相較于現(xiàn)有的提純方法，可更快地獲得高純度、高活性、低分化的間充質(zhì)干細(xì)胞。可以作為治療脊髓損傷，椎間盤(pán)退變，纖維環(huán)修復(fù)的種子細(xì)胞，具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

參 考 文 獻(xiàn)

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