張艷海， 其布勒哈斯， 金 燕* ， 王 佳， 馬文麗

（1. 賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海201206；2. 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特001150）

維生素A（vitamin A（VA），retinol）、維生素D（vitamin D2（VD2）和vitamin D3（VD3））、維生素E（vitamin E（VE），tocopherol）是機體維持正常代謝和機能所必需的脂溶性維生素。維生素A 又稱為視黃醇，具有促進機體生長、維持表皮完整等功能。維生素D 主要包括維生素D2（麥角鈣化醇）和維生素D3（膽鈣化醇），對哺乳動物具有促進鈣磷代謝及成骨作用。維生素E 又稱為生育酚，由于母生育酚環(huán)上甲基取代的變化有8 種活性形式，包括α、β、γ、δ-生育酚等。其中α-生育酚因為活性最高，具有抗氧化、抗衰老等作用，在食品科學(xué)中通常被單獨考慮［1］。嬰幼兒及成人配方乳品和動物飼料是脂溶性維生素強化的兩種重要形式。目前對以上產(chǎn)品中維生素D 的分析主要存在以下3 個難點：一是維生素D 對溫度、光照、氧氣和極端pH 值較敏感，一般經(jīng)過包被制成水分散微粒，再添加到食品基質(zhì)中［2，3］，所以在前處理中往往需要將維生素D 從基質(zhì)中釋放出來；二是食品基質(zhì)成分復(fù)雜，一般含有脂肪、乳化劑、蛋白質(zhì)、甾醇等，另外還有甘油三酯、類胡蘿卜素、類固醇和磷脂等與目標(biāo)物極性類似的化合物，因此樣品前處理一般需要凈化過程；三是維生素D 在樣品中含量低，尤其在母乳和牛奶中含量極低［4］，因此對檢測方法的靈敏度要求較高。基于以上難點，一般的樣品前處理方法中常包含皂化破壁、有機溶劑萃取、濃縮和凈化等步驟［5-7］，尤其是我國［5］和歐洲［8］關(guān)于食品中維生素D 的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分析方法，需采用正相制備色譜、反相分析色譜兩套儀器，分別進行凈化制備和分析，前處理過程極其繁瑣，大大影響樣品的分析效率。而結(jié)合多種分離機理的多維色譜分離模式，可以提高色譜系統(tǒng)的分離能力，擴大分離空間，增加色譜峰容量，減少色譜峰重疊［9］。在多維色譜分離手段中最常見的二維色譜分離技術(shù)已被越來越多地應(yīng)用到食品分析中［10，11］。

本文采用在線二維液相色譜法（2D-LC）測定嬰幼兒和成人配方乳品中的維生素A、D3和E，其中一維和二維分離均基于反相色譜。樣品經(jīng)過皂化、萃取后，直接進樣分析，一次進樣即可在線完成樣品中維生素A、D3和E 的定量，提高了方法的準(zhǔn)確性和樣品的分析效率。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

雙三元液相色譜（DGLC）系統(tǒng)（Thermo Fisher，USA），配置包括6 通道真空脫氣機SRD3600、雙梯度分析型色譜泵（DGP3600）、自動進樣器（WPS3000TSL）、二極管陣列檢測器（DAD3000）、柱溫箱（TCC-3000，配有一個2 位置六通閥和一個2 位置10 通閥）、Acclaim 120 C8 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）和Accucore Polar Premium 色譜柱（C18 柱）（150 mm×3.0 mm，2.6 μm）、變色龍色譜管理軟件（Chromeleon 7.2 SR1）。

維生素D3（純度≥95%，HPLC 級）和維生素D2（純度≥95%，HPLC 級）均由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用；維生素A（all-trans retinol，純度＞95%）購自Acros Organics 公司；維生素E（純度≥96%，HPLC 級）購自Sigma 公司。KOH（分析純）和抗壞血酸（純度≥95%，分析純）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜級）購自Fisher 公司；去離子水（18.2 MΩ·cm）由Millipore 純水機制得；嬰幼兒配方奶粉和液態(tài)乳品由蒙牛乳業(yè)提供。

1.2 樣品制備

參考國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5413.9-2010）［5］，精密稱取奶粉10 g（液態(tài)奶50 g）于250 mL 錐形瓶中，加入30 mL 熱水溶解（液態(tài)奶不需加入）后，再依次加入100 mL 15 g／L 的維生素C 乙醇溶液、25 mL 1.25 kg／L KOH 溶液和1.0 mL 10 mg／L 維生素D2內(nèi)標(biāo)溶液，磁力攪拌45 min，溫度53 ℃。之后將皂化液轉(zhuǎn)移至500 mL 分液漏斗中，以石油醚萃取3次，每次用100 mL 石油醚，然后用水洗滌3 ～5 次合并后的萃取液至中性（pH 試紙測試），收集石油醚層，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水干燥。最后低溫減壓回收石油醚至萃取液剩余1 ～2 mL 時轉(zhuǎn)移至10 mL 棕色瓶中，氮氣吹干，以3 ～5 mL 甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻，放入4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以甲醇溶解維生素A、D2、D3和E 標(biāo)準(zhǔn)品制成4 種維生素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，質(zhì)量濃度分別為1.24、1.00、1.00 和2.06 g／L。再用甲醇將上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋100 倍后備用。

1.4 儀器條件

DGLC 系統(tǒng)的左泵作為一維分析泵，以C8 柱為一維分析柱，梯度洗脫，流速0.4 mL／min；以DGLC 的右泵作為二維分析泵，以C18 柱為二維分析柱，梯度洗脫，流速0.5 mL／min，柱溫30 ℃，流動相均為乙腈（A）、甲醇（B）和水（C）；檢測波長分別設(shè)為263 nm （維生素D3）、296 nm （維生素E）和325 nm （維生素A）；進樣體積10 μL；收集定量環(huán)（loop 環(huán)）的體積為500 μL。系統(tǒng)流路連接見圖1，梯度洗脫程序及閥切換時間見表1 和表2。

圖1 全自動在線二維柱切換系統(tǒng)流路示意圖Fig.1 Flow scheme of fully-automated online two-dimensional column switching system

表1 一維分離和二維分離的梯度洗脫程序Table 1 Gradient programs of the two-dimensional separation

表2 閥切換時間及過程Table 2 Times and processes of valve switching

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)流路的構(gòu)建

本文在前期研究［12］中，建立了嬰幼兒配方奶粉中維生素A、D3和E 的全自動二維分離系統(tǒng)，但該方法存在以下缺點：一是由于一維和二維色譜柱的串聯(lián)，在將目標(biāo)餾分從一維色譜柱直接轉(zhuǎn)移至二維色譜柱時系統(tǒng)壓力會驟然升高，對色譜柱造成損傷；二是每次分析都需校正維生素D3在一維色譜中的保留時間，以重新確認切割時間窗口，否則會造成目標(biāo)物在切割過程中損失。針對以上問題，本文對系統(tǒng)流路進行了優(yōu)化：首先采用500 μL 定量環(huán)收集一維目標(biāo)餾分，避免切換過程中系統(tǒng)壓力的驟然變化；另一方面在定量環(huán)中預(yù)先填充高比例水相的溶劑，可以稀釋一維分離中的流動相，減少了溶劑效應(yīng)。二是將二極管陣列檢測器置于收集餾分的定量環(huán)之前，這樣可根據(jù)維生素D3在一維色譜柱中的出峰時間隨時調(diào)整切割時間窗口，保證目標(biāo)物能100%地從一維色譜柱切割至二維色譜柱中。如圖2 所示，0 ～20 min 為一維分離過程，其中高濃度的維生素D3（5.0 mg／L）出峰時間窗口僅為0.3 min，為保證目標(biāo)物全部切割至二維色譜柱中，將時間適當(dāng)調(diào)寬為15.75 ～16.20 min，切割時間窗口為0.45 min。另外，可以根據(jù)保留時間的變化，靈活設(shè)定右閥的切換時間，以保證目標(biāo)物在切割過程中無損失。優(yōu)化后的系統(tǒng)流路可實現(xiàn)在第一維色譜柱上進行維生素A 和E 的定量及維生素D3的凈化，在第二維色譜柱上進行維生素D3的定量分析。整個過程在密閉系統(tǒng)內(nèi)自動化完成。

2.2 二維色譜條件的優(yōu)化

一維分離機理和二維分離機理保持最大差異性或正交性是構(gòu)建良好二維分離體系的關(guān)鍵。在我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法中，正相色譜的分離凈化結(jié)合反相色譜的定量分析，是正交性較好的“離線二維”分離過程，但實現(xiàn)正相色譜和反相色譜在線二維分離十分困難。目前多采用微柱［13，14］或在線蒸發(fā)接口技術(shù)［15］，雖然可解決溶劑兼容性問題，并減小正相色譜流動相對反相分離的溶劑效應(yīng)，但對于常規(guī)樣品的檢測分析，還不具有普遍實用性。因此本文在一維和二維分離中均采用以疏水保留為主的反相色譜分離模式，一維為C8 柱，二維為極性嵌合的反相色譜柱，根據(jù)Snyder 等［16］的疏水減法模型，兩根色譜柱的正交因子（Fs）為65，滿足正交分離的條件，可作為正交色譜柱使用。由于C8 柱對脂溶性物質(zhì)的保留較C18 柱弱，因此一維分析可以選擇洗脫能力相對“較弱”的流動相，即可將維生素D3從一維轉(zhuǎn)移至二維色譜柱中，從而減少溶劑效應(yīng)的影響；另外，在色譜柱規(guī)格選擇上，一維分離選擇窄徑柱有助于“壓縮”譜峰，減小目標(biāo)餾分的洗脫體積，從而減小溶劑效應(yīng)。

圖2 為4 種維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的二維分離圖。從0 ～20 min 的一維譜圖可以看出，維生素A和E 分離較好，可滿足測定要求，說明C8 柱可以兼顧維生素A 和E 的分離；另外，維生素D2和D3在一維C8 色譜柱中未被分離，二者保留時間相同，被“壓縮”成了一個峰，因此縮小了一維的切割時間窗口，這樣既減小了對二維分離的溶劑效應(yīng)，又可避免過多基質(zhì)成分因窗口過大切割進入二維色譜柱中而造成干擾；在20 ～30 min 的二維分離中，維生素D3的色譜峰對稱因子為1.05，對稱性較好，維生素D2和D3的分離度為2.16，達到了基線分離。另取嬰幼兒配方奶粉樣品，按照1.2 節(jié)方法制備樣品溶液，進樣分析。從圖3 嬰幼兒配方奶粉樣品分離譜圖可以看出，4 種維生素分離較好，其中維生素D3色譜峰在峰頂點、前沿和后沿50% 處的紫外吸收光譜圖較均勻一致，可判斷維生素D3 色譜峰的純度較好，樣品基質(zhì)無干擾，方法專屬性較好。

2.3 維生素D 定量方法的選擇

GB 5413.9-2010［5］采用外標(biāo)法測定嬰幼兒配方營養(yǎng)品中維生素D 的含量，由于維生素D 的絕對回收率較低，需要用回收率對每批的測定結(jié)果進行校正。但在實際分析中，每個樣品的回收率不可能一致，因此會導(dǎo)致最終的測定結(jié)果重現(xiàn)性較差。本文參考歐洲食品標(biāo)準(zhǔn)［8］，采用內(nèi)標(biāo)法定量。維生素D2和D3是維生素D 的主要活性化合物，二者均為開環(huán)甾體類化合物，結(jié)構(gòu)相似，理化性質(zhì)相近，因此可互為內(nèi)標(biāo)物。另外，本文采用反相色譜法分離，可以將維生素D2和D3基線分離，維生素D2可以校正樣品在皂化及萃取等前處理過程中維生素D3的損失，提高方法的準(zhǔn)確度。從圖4 可以看出維生素D2和D3在二維色譜柱中分離較好，且沒有樣品基質(zhì)干擾，表明了內(nèi)標(biāo)法的可行性。

圖3 嬰幼兒配方奶粉樣品中4 種維生素的（a）二維分析譜圖和（b）20 ～30 min 的二維分離放大圖譜Fig.3 （a）Two-dimensional chromatograms and （b）the second dimensional enlarged chromatograms from 20 to 30 min of the four vitamins in an infant formula sample

圖4 （a）VD2 和VD3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、（b）加VD2 內(nèi)標(biāo)的樣品溶液和（c）未加VD2 的樣品溶液的譜圖Fig.4 Chromatograms of （a）a mixed standard solution of VD2 and VD3，（b）a sample solution spiked with VD2 as internal standard and （c）a sample solution without VD2

2.4 線性關(guān)系、精密度和定量限

分別精密量取維生素D3、A 和E 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，置于不同的10 mL 棕色量瓶中，配成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別精密加入1.0 mL 質(zhì)量濃度為10 mg／L 的維生素D2作內(nèi)標(biāo)，進樣10 μL。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，維生素D3與維生素D2的峰面積比值為縱坐標(biāo)，維生素A 和E 均以峰面積為縱坐標(biāo)，做線性回歸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素D3在0.02 ～5.0 mg／L 范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r 為0.999 6，維生素A 在0.62 ～124 mg／L 范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r為0.999 1，維生素E 在0.824 ～1 030 mg／L 范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r 為0.997 8，表明各目標(biāo)物線性關(guān)系良好。按S／N ＝10 確定目標(biāo)物的定量限，維生素D3的定量限為0.015 mg／L，維生素的定量限為0.040 mg／L；維生素E 的定量限為0.339 mg／L。

取0.1 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣6 次，計算得到維生素D3、A 和E 峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.0%、0.93% 和1.01%。結(jié)果表明該方法在連續(xù)進樣時精密度較好。

2.5 回收率

精密稱取嬰幼兒配方奶粉和液態(tài)奶樣品，其中固體樣品每份10 g，液體樣品50 g，分別加入適量的維生素A、維生素D3和維生素E 標(biāo)準(zhǔn)品（見表3 和表4），按照1.2 節(jié)所述方法制備樣品溶液，測定3種維生素的含量，計算回收率。結(jié)果顯示，維生素D3的加標(biāo)回收率為75.50% ～85.00%。維生素A的加標(biāo)回收率為91.2% ～103.7%；維生素E 的加標(biāo)回收率為89.2% ～95.6%。

表3 嬰幼兒配方奶粉樣品中維生素A 和E 的加標(biāo)回收率（n＝3）Table 3 Recoveries of vitamins A and E spiked in a infant formula sample （n＝3）

2.6 實際樣品測定及與標(biāo)準(zhǔn)方法比較

采用本法隨機測定了嬰幼兒、學(xué)生、中老年配方奶粉，奶酪和酸奶等強化乳品中維生素A、D3和E的含量，并與我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分析方法（GB 5413.9-2010）［5］的測定結(jié)果進行對比，結(jié)果見表5，其中維生素D3的對比結(jié)果見圖5。采用配對t 檢驗法對數(shù)據(jù)結(jié)果進行了統(tǒng)計學(xué)分析，t 檢驗表明差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可認為兩種方法對維生素A、D3和E 的測定結(jié)果基本一致。

表4 樣品中維生素D3 的含量及其加標(biāo)回收率（n＝3）Table 4 Contents and spiked recoveries of vitamin D3 in samples （n＝3）

圖5 采用本法與標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5413.9-2010）測定樣品中維生素D3 含量的結(jié)果對比Fig.5 Result comparison of vitamin D3 in samples using this method and the standard method （GB 5413.9-2010）

表5 兩種方法測定樣品中維生素A 和E 的含量Table 5 Contents of vitamins A and E in different samples with the two methods

3 結(jié)論

本文基于在線二維液相色譜分離技術(shù)建立了快速、同時測定嬰幼兒配方乳品、強化乳品中維生素A、D3和E 的分析方法。本文采用新的系統(tǒng)連接方式，減小了一維流動相對二維分離所造成的溶劑效應(yīng)，避免了切換過程中系統(tǒng)壓力驟升對分析柱造成的損傷，并且可隨時根據(jù)目標(biāo)物在一維色譜柱的出峰起止時間，靈活調(diào)整切割時間窗口大小，避免目標(biāo)物在切換過程中的損失。另外，一維和二維色譜柱良好的二維正交性改善了系統(tǒng)的分離能力。最后，通過將本方法與GB 5413.9-2010 標(biāo)準(zhǔn)方法比較，采用配對t 檢驗分析，表明兩種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本方法簡便、快速，自動化程度高，重現(xiàn)性好，方法回收率高，因此可作為配方奶粉或其他乳品中維生素A、D3和E 的測定方法推廣應(yīng)用。

［1］ Mcmahon A，Christiansen S，Shine L，et al. J AOAC Int，2013，96（5）：1073

［2］ Perales S，Alegría A，Barberá R，et al. Food Sci Technol Int，2005，11（6）：451

［3］ Zhao R，Xue Y，Wu G H，et al. Chinese Journal of Chromatography （趙榕，薛穎，吳國華，等. 色譜），2008，26（1）：113

［4］ Hollis B W，Ross B A，Draper H H，et al. J Nutr，1981，111（7）：1240

［5］ GB 5413.9-2010

［6］ Heudi O，Trisconi M J，Blake C J. J Chromatogr A，2004，1022：115

［7］ Stevens J，Dowell D. J AOAC Int，2012，95（3）：577

［8］ BS EN 12821：2009

［9］ Giddings J C. J Chromatogr A，1995，703：3

［10］ Herrero M，Ibanez E，Cifuentes A，et al. J Chromatogr A，2009，1216：7110

［11］ Ma J，Hou X F，Zhang B，et al. J Pharmaceut Biomed，2014，91：24

［12］ Zhang Y H，Zhu X Y，Cao G Z，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry，2013，41（5）：771

［13］ Dugo P，F(xiàn)avoino O，Luppino R，et al. Anal Chem，2004，76（9）：2525

［14］ Pavel J，Jan F，Lahovska H. J Chromatogr A，2006，1119：3

［15］ Ding K，Xu Y，Wang H，et al. J Chromatogr A，2010，1217：5477

［16］ Snyder L R，Dolan J W，Carr P W. J Chromatogr A，2004，1060：77