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        生物介質(zhì)萃取技術研究進展*

        2015-12-24 05:20:42張倩陳岑楊豐慶夏之寧
        化學分析計量 2015年3期
        關鍵詞:黃曲霉霉菌吸附劑

        張倩,陳岑,楊豐慶,夏之寧

        (重慶大學化學化工學院,重慶 400030)

        近年來,以生物材料(細胞、細胞膜、仿生細胞膜、細菌及蛋白質(zhì)等)為介質(zhì)的萃取技術逐漸發(fā)展成為一種特殊的樣品前處理方法,在天然產(chǎn)物研究、環(huán)境分析及食品分析領域得到了較為廣泛的應用。以下總結(jié)近年來生物介質(zhì)萃取技術在微量重金屬離子富集及霉菌毒素純化檢測等方面的應用研究進展,為該技術的進一步推廣應用提供參考。

        1 痕量金屬測定——生物富集

        對微量或痕量金屬污染物進行準確的含量測定一直是環(huán)境保護、食品藥品質(zhì)量控制、農(nóng)業(yè)化學及高純度材料制造等領域的重要內(nèi)容。目前金屬元素含量測定的主要方法包括紫外分光光度法、原子吸收法、原子熒光法、X熒光光譜、電感耦合等離子質(zhì)譜法等[1]。由于污染物中金屬元素濃度通常較低且檢測容易受到基質(zhì)的干擾,在測定之前需要對微量金屬元素進行預濃縮、或與基質(zhì)分離以提高檢測靈敏度和選擇性。

        金屬可以與生物材料如真菌表面所含有的羧基、羥基、硫酸根、磷酸根、氨基等功能基團結(jié)合,因而可以采用生物材料對樣品中的金屬元素進行富集[2]。用生物材料吸附重金屬避免了有機金屬絡合劑的使用,不會產(chǎn)生二次污染;并且生物材料來源廣泛,作為吸附劑可以降低處理成本。因此近年來多種生物材料被用于測定痕量金屬離子過程中的樣品處理,有關生物介質(zhì)用于富集的技術得到了發(fā)展[2]。目前最常用的生物吸附劑主要有藻類、細菌及真菌等(如表1)。

        在所有微生物吸附劑中,真菌的應用最為廣泛,其次是細菌和藻類(如圖1)。真菌通常分為三類:酵母菌、霉菌和蕈菌(大型真菌),它們分別歸屬于不同的亞門。三種真菌中,酵母菌對重金屬的吸附能力最強,應用也最多。而在酵母菌中,最具代表性的是釀酒酵母。Pescim等[5]以釀酒酵母-瓊脂糖凝膠為吸附劑結(jié)合薄膜擴散梯度技術(DGT)富集海水及河水中的鉛(Pb)。首先將酵母與瓊脂糖溶液混合制成瓊脂糖凝膠-酵母盤,作為薄膜擴散梯度技術的結(jié)合劑來富集Pb離子,富集完成后用HNO3沖洗溶解瓊脂糖,從結(jié)合劑中回收Pb并用電感耦合等離子體光譜法(ICP-OES)測定。該方法成功實現(xiàn)了河水中原位總Pb濃度的測定,同時由于Pb在海水中的多種存在形式[Pb2+,Pb(OH)+,Pb(OH)2,Pb(OH)-,Pb(OH)42-]中,只有Pb2+能被釀酒酵母-瓊脂糖凝膠盤吸附,所以該方法也實現(xiàn)了海水中Pb2+的分離。

        表1 生物介質(zhì)在重金屬離子富集中的應用

        圖1 各種微生物吸附劑在金屬分析中的應用情況[24]

        除酵母外,許多大型真菌也具有重金屬吸附能力。Sadin等[9]將杏鮑菇固定在非離子型大孔樹脂Amberlite XAD-16上作為固相吸附劑富集蔬菜中的Cd2+和Co2+,再用ICP-OES測定。通過對影響固相萃取的關鍵因素(樣品溶液的pH、萃取液流速、生物吸附劑的類型、洗脫劑用量及上樣量)進行優(yōu)化,分別提高了Cd2+和Co2+兩種離子的檢測敏感度50.7和35.7倍。并且成功應用于不同蔬菜(馬齒莧、洋蔥、紫花南芥、秋葵、茄子)的不同部位(葉、根、莖、果)中Cd2+和Co2+的含量測定。

        細菌之所以被用作生物吸附劑源于它們體積小、來源廣,能在可控制的條件下生長并且對大范圍環(huán)境變化具有極強的適應性[2]。細菌吸附重金屬的功能基團主要是細胞壁上的羰基、膦基、胺基和羥基等。許多細菌種屬包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、埃希氏菌屬、微球菌屬等都具有吸附金屬或有機物的能力[2]。釷是一種放射性元素,在室溫下很穩(wěn)定,所以直接化學毒性很低,但是釷細粉容易自燃轉(zhuǎn)化為氧化物,當其硝酸鹽進入人體后會以有毒的氫氧化物形式沉積在人體的肝、脾、骨髓等處造成內(nèi)照射[25]。Ozdemir等[14]采用芽孢桿菌-Amberlite XAD-4大孔吸附樹脂吸附結(jié)合紫外-可見分光光度法對釷進行含量測定。通過考察主要影響因素包括溶液pH、洗脫液的類型及體積、洗脫液流速等對富集效果的影響,最終得到的優(yōu)化吸附體系對釷的吸附容量為17.2 mg/g,該體系成功應用于礦樣中釷含量的測定。

        藻類細胞表面具有潛在的金屬結(jié)合基團包括羧酸酯、胺基、咪唑基、巰基、磷酸基和羥基等。研究表明褐藻吸收能力比紅藻和綠藻高,是最常作為生物吸附劑的藻類[26]。Salman等[18]探究褐藻中的墨角藻對Cu2+的吸附性能,對從水溶液中吸附Cu2+過程的平衡等溫曲線和動力學性質(zhì)進行了研究。三種等溫吸附模型Langmuir、Freundlich和Dubinin-Radushkevich中,Langmuir模型最貼近實驗平衡數(shù)據(jù)。Langmuir模型的理論結(jié)果得出該吸附過程的平衡時間是340 min,最大吸附量為1.85 mmol/g,表明墨角藻是廢水中Cu2+的有效吸附劑。

        另有研究用浮游動物的休眠卵作為生物吸附劑。該休眠卵有3個特點:含有結(jié)晶磷酸鈣和磁性材料[27];含有23%~25%的甲殼素(很強的金屬吸附能力)[28-29];表面具有蜂窩狀結(jié)構(gòu),比表面積較大[27]。Sa?mac等[23]將3種不同浮游動物(水蚤,枝角類,甲殼類動物)的休眠卵裝入玻璃管中,分別加入待分析樣品,同步富集多種樣品中的Cd2+,Co2+,Cu2+,Mn2+和Ni2+等微量金屬元素,并采用火焰原子吸收光譜(FAAS)法測定其含量,成功應用于環(huán)境樣品中上述金屬元素的分析檢測。

        此外一些植物來源的生物材料也可以作為金屬吸附劑。例如劍麻(劍麻纖維)可以從水體中吸附Pb2+和Cd2+[30];辣木樹皮能有效移除水溶液中的Ni2+[31],辣木殼對水中的Cr2+也有吸附作用[32];許多植物的種子、樹葉以及莖皮具有金屬吸附作用[33]。

        2 霉菌毒素檢測——免疫親和層析

        霉菌毒素是絲狀真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,結(jié)構(gòu)多樣。飼料、食品中的霉菌素會引起食物中毒,有些還會致癌、致畸、致突變,對禽畜和人類健康造成極大的威脅。不同種類的霉菌素對人類的毒性大小不一?,F(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)300多種霉菌毒素,按其主要產(chǎn)毒菌種可分為曲霉菌毒素(黃曲霉、雜色曲及赭曲霉)、鐮刀菌毒素(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮及T-2毒素)和青霉菌毒素(桔青霉素、展青霉素及青霉酸)[34]。

        大多數(shù)霉菌素的化學性質(zhì)很穩(wěn)定,在儲存和處理過程中不受影響,因此控制霉菌素最好的手段是預防。毒素的檢測屬于痕量分析,加上毒素多變的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),因而需要利用一定的前處理方法除去提取物中的干擾成分及富集樣品中的毒素成分。真菌毒素是一類小分子半抗原,具有反應原性,能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應。免疫親和層析(IAC)正是利用真菌毒素的這種性質(zhì),采用抗真菌毒素單克隆抗體特異性純化提取真菌毒素的技術。比起傳統(tǒng)的提取方法,IAC具有特異性和選擇性強、純化過程迅速、有毒溶劑少等優(yōu)點[35]。食品、藥物、飼料等樣品中霉菌毒素檢測方法見表2。

        表2 免疫親和柱用于霉菌素檢測的樣品前處理

        黃曲霉毒素是黃曲霉家族成員黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一類聚酮化合物,目前已經(jīng)分離得到了20多種該類化合物。黃曲霉毒素是一種毒性極強的肝毒素,許多藥物與食物都要求檢測黃曲霉毒素的含量[45-46]。Ma等[38]將單克隆抗體1C11固定在氨基硅膠微粒上制備成IAC柱,結(jié)合HPLC熒光檢測器檢測農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素含量。首先用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽使硅膠微粒上的氨基與單克隆抗體1C11上的羰基交聯(lián)形成免疫吸附劑,用近紅外光譜(NIR)對抗體-氨基硅膠微粒結(jié)合物進行表征。對固載、洗滌、洗脫溶液種類和用量等條件進行優(yōu)化后,親和柱對黃曲霉毒素的吸附容量達到200 ng。所建立的方法對黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2的檢測限均在0.09 μg/kg以下(S/N=3)。

        玉 米 赤 霉 烯 酮(Zearalenone,ZON)是 鐮 刀 菌(Fusarium)的一種真菌毒素,主要污染玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物。ZON及其代謝物赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZOL)和β-赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZOL)都具有雌激素樣作用,能造成動物急慢性中毒,導致動物繁殖機能異常甚至死亡[47]。我國規(guī)定ZON在小麥和玉米中的限量為60 μg/kg,在動物飼料中為500 μg/kg。但ZON作為小分子物質(zhì)通常在樣品中含量很少,且樣品中的其它成分極易對ZON的檢測造成影響,所以可靠的樣品預處理純化手段顯得尤為重要。Tang等[36]應用對ZON敏感度最高的單克隆抗體2D3偶聯(lián)CNBr-Sepharose4B(溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B)IAC柱對玉米中的ZON進行純化前處理。反復調(diào)節(jié)樣品用量,用HPLC法分析確定IAC柱對ZON的最大吸附容量為103 ng,回收率實驗也證明該柱子的穩(wěn)定性(3次回收率測定結(jié)果分別為93.4%,99.1%,99.6%,且重現(xiàn)性好)。結(jié)合直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(icELISA)測定玉米中的ZON含量,經(jīng)過優(yōu)化,ZON的IC50值為0.02 μg/L。單克隆抗體2D3對ZON(100%)和β-ZOL (88.2%)的識別度都很高,兩種物質(zhì)的交叉反應率分別是4.4%和4.6%。顯示這種方法可以用于更多的農(nóng)產(chǎn)品和食品中ZON的檢測。

        利用IAC技術測定微量霉菌毒素的其它例子見表2。針對不同霉菌素采用不同的單克隆抗體制成的IAC柱,對食物、中草藥中的赭曲霉素A[40]、T-2和HT-2毒素[44]、脫氧瓜萎鐮菌醇[43]、伏馬毒素(Fumonisin)[41]等進行純化,結(jié)合色譜法測定毒素含量,都獲得了良好的效果。

        IAC柱除了應用于霉菌素的檢測之外,尚有一些其它方面的應用。例如嚴兵等[48]在免疫健康實驗獺兔體內(nèi)制備出針對青霉素酶的特異性抗體血清,將該抗體純化后與CNBr-Sepharose-4B偶聯(lián)制成IAC柱,結(jié)合毛細管電泳法測定了牛奶中的青霉素含量。封琳等[49]將豬瘟病毒與環(huán)氧氯丙烷活化的Sepharose-4B偶聯(lián)制備IAC柱,從豬瘟病毒中分離豬瘟病毒抗體,應用SDS-PAGE和ELISA進行抗體純度檢測,結(jié)果顯示純化的豬瘟病毒抗體純度高、活性強。異丙隆和敵草隆是具代表性的苯脲類除草劑,因易于經(jīng)土壤和地下水進入人畜飲水系統(tǒng)而受到關注。張秀莉等[50]首次制備了敵草隆抗體免疫柱,將該免疫柱與LC-MS/MS離線聯(lián)用測定了河水中ng/L水平的異丙隆。

        3 結(jié)語

        雖然樣品來源不一,目標物質(zhì)和檢測技術各式各樣,但從分離實質(zhì)上來說,生物介質(zhì)萃取都是基于樣品對象中的成分與生物材料的親和作用力大小不同,選擇性保留與生物材料有特異性作用的成分,除去其中的干擾成分,亦即用生物材料作為介質(zhì)來選擇性富集目標成分的過程。該項技術的主要優(yōu)點可歸結(jié)為以下兩點:(1)生物材料的組成比其它無機、有機的化學物質(zhì)更復雜,能夠提供更多結(jié)合位點,可以實現(xiàn)多種物質(zhì)如多種金屬元素的同時富集;(2)生物材料的使用符合綠色化學概念,在樣品預處理過程中,幾乎不使用有毒溶劑,對環(huán)境無負擔,用于一些食品藥品相關物質(zhì)的分析檢測時,更為安全。

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