韓正祥　張夢瑾　徐　杰　王紅梅　杜秀平　陳　翀　徐開林(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，徐州221002)

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GST-NRP-1融合蛋白的原核表達及純化①

韓正祥張夢瑾徐杰王紅梅杜秀平陳翀徐開林②
(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，徐州221002)

［摘要］目的:構(gòu)建帶有GST標簽的人NRP-1融合蛋白原核表達載體，在大腸埃希菌(E.coli)中誘導(dǎo)其表達，并進行包涵體的復(fù)性及純化。方法:利用RT-PCR擴增人NRP-1基因，將其克隆至pCR-blunt載體，酶切制備NRP-1基因片段，插入表達載體pGEX-4T-1，生成pGEX-4T-1-NRP-1，轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞以IPTG誘導(dǎo)其蛋白的表達。裂解細菌后行Western blot檢測GST-NRP-1融合蛋白的表達，表達的包涵體經(jīng)復(fù)性后用Glutathione Sepharose 4B純化。結(jié)果: RT-PCR擴增出NRP-1基因并連入pCR-blunt載體;經(jīng)亞克隆構(gòu)建了融合蛋白表達載體pGEX-4T-1-NRP-1。轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞后考馬斯亮藍染色檢測到GST-NRP-1融合蛋白的表達，經(jīng)包涵體復(fù)性后得到純化的融合蛋白。結(jié)論:成功構(gòu)建帶有GST標簽的人NRP-1融合蛋白原核表達載體，為進一步研究NRP-1的結(jié)構(gòu)、功能及其與之相互作用的蛋白奠定了基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］NRP-1;原核表達;融合蛋白;純化

①本文受國家自然科學(xué)基金(No.30901753)和江蘇省“六大人才高峰”B類項目資助(No.2014-WSW-040)。

②徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科，徐州221002。

Prokaryotic expression and purification of GST-NRP-1 fusion protein

HAN Zheng-Xiang，ZHANG Meng-Jin，XU Jie，WANG Hong-Mei，DU Xiu-Ping，CHEN Chong，XU Kai-Lin.Department of Oncology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China

［Abstract］Objective: To construct GST-tagged human NRP-1 fusion protein expression vector and induce its expression in Escherichia coli (E.coli)，then carry on inclusion body refolding and purification so as to obtain GST-NRP-1 fusion protein.Methods: NRP-1 gene was amplified by RT-PCR and inserted into pCR-blunt vector.Then the reconstructed plasmid was inserted into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1.The constructed pGEX-4T-1-NRP-1 expression vector was transformed into BL21 cells and induced by isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) .Bacterial bodies were disrupted by sonication.Then the soluble fraction of fusion proteins were verified by Western blot and purified by Glutathione Sepharose 4B after inclusion body refolding.Results: The NRP-1 gene fragment was amplified by RT-PCR and inserted into pCR-blunt vector.Fusion protein expression vector pGEX-4T-1-NRP-1 was constructed successfully.After transformation，GST-NRP-1 expression vector was detected in BL21 cells and obtained purifying protein after refolding.Conclusion: The plasmid GST-NRP-1 was constructed successfully and laid basis for subsequent studies.

［Key words］NRP-1; Prokaryotic expression; Fusion protein; Purification

Neuropilins(NRPs)是一種跨膜糖蛋白受體，由含860個氨基酸組成的細胞外結(jié)構(gòu)域、23個氨基酸組成的跨膜結(jié)構(gòu)域以及40個氨基酸組成的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域共同組成。NRPs最初被發(fā)現(xiàn)是作為semaphorin的受體，調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞和軸突的生長［1］。后來研究證實，作為VEGF的共受體，NRPs可以和VEGFR通過NRP的PDZ結(jié)合域形成NRP1-VEGFR復(fù)合受體，進而強化VEGF的血管生成作用［2］;因NRP-1的胞內(nèi)區(qū)短小，一般認為自身無信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。但近來Wang等［3］通過對NRP-1的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的研究，證實NRP-1能單獨介導(dǎo)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移，并且胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中C末端的三個氨基酸在此功能中發(fā)揮重要作用。這提示NRP-1具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控功能，但NRP-1通過何種機制調(diào)控其下游信號仍有待進一步確定。蛋白質(zhì)組學(xué)手段是研究NRP-1與其偶聯(lián)的接頭蛋白相互作用，進而探索NRP-1作用機制的有效方法。GST-pulldown-質(zhì)譜分析是捕捉和鑒定蛋白質(zhì)間相互作用的高效手段。本研究探討和優(yōu)化了GST-NRP-1融合蛋白的制備流程，為蛋白質(zhì)組學(xué)水平上解析NRP-1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供工具，后續(xù)的GST-pulldown和質(zhì)譜鑒定可進一步深入揭示NRP-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的信號網(wǎng)絡(luò)和作用機制，為腫瘤的治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑總RNA提取試劑TRIZOL、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司，PhusionDNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自美國NEB公司; 1 kb DNA分子質(zhì)量標記物及蛋白分子量標準購自立陶宛Fermentas公司; GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司; IPTG購自Sigma公司; PMSF、丙烯酰胺及雙丙烯酰胺購自Amresco公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)。

1.1.2質(zhì)粒及細胞株克隆載體pCR-blunt購自美國Invitrogen公司;表達載體pGEX-4T-1購自GE Healthcare公司;大腸桿菌TOP10、BL21均購自美國Invitrogen公司。

1.1.3引物設(shè)計根據(jù)Genbank公布的NRP-1的cDNA序列用Primer 5軟件設(shè)計PCR引物。不帶酶切位點的上游引物: CGGAGAAGGGAGAATGGAGAG，帶有酶切位點的上游引物: TggatccGAGAGGGGGCTGCCGC，下游引物: TTATTTGATACCTGATTGTATGGTGCTG。

1.2方法

1.2.1目的基因的克隆TRIZOL法從高表達NRP-1的MCF-7乳腺癌細胞株中提取細胞mRNA，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用Phusion聚合酶擴增NRP-1的CDS區(qū)，NRP-1的PCR擴增條件如下: 98℃2 min預(yù)變性，98℃30 s，68℃30 s，72℃2 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸2 min。取5 μl PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定并回收目的片段。使用T4 DNA連接酶將NRP-1基因片段連入克隆載體pCR-blunt，轉(zhuǎn)TOP10感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆。EcoRⅠ單酶切初步鑒定重組質(zhì)粒，將鑒定正確的質(zhì)粒寄往Invitrogen公司上海測序部進行DNA測序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCR-blunt-NRP-1。

1.2.2 pGEX-4T-1-NRP-1表達載體的構(gòu)建及鑒定

重新設(shè)計有BamHⅠ酶切位點的上游引物，以測序正確菌液的小提質(zhì)粒為模板重新PCR后連接至pCR-blunt載體上，且測序結(jié)果正確。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCR-blunt-NRP-1及pGEX-4T-1質(zhì)粒后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定并回收目的片段NRP-1和線性化質(zhì)粒pGEX-4T-1。使用T4 DNA連接酶將NRP-1基因片段與線性化質(zhì)粒pGEX-4T-1連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。

1.2.3融合蛋白GST-NRP-1的誘導(dǎo)表達將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細菌，在含有氨芐青霉素(Amp)的LB上37℃培養(yǎng)過夜后篩選并提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ再次雙酶切后鑒定陽性克隆BL21菌種。在Ampr瓊脂平板上挑選單菌落接種于LB/Amp液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜后，次日按1∶100轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至A600約為0.5時，加誘導(dǎo)劑IPTG 37℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)6 h，取超聲破碎后樣品收集上清及包涵體，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示表達產(chǎn)物主要以不溶性包涵體存在。

1.2.4目的蛋白誘導(dǎo)劑的選擇將表達菌pGEX-4T-1-NRP-1 37℃搖床過夜，次日以1∶100轉(zhuǎn)接，震蕩培養(yǎng)至A600為0.5左右時，取培養(yǎng)的菌液15 ml，加入IPTG濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h，4℃10 000 r/min離心5 min收集菌體，200 μl PBS重懸細菌，加入50 μl 5×上樣緩沖液，加熱煮沸5 min，取10 μl行10%SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍染色并脫色。

1.2.5目的蛋白誘導(dǎo)時間的選擇將表達菌pGEX-4T-1-NRP-1 37℃搖床過夜，次日以1∶100轉(zhuǎn)接，震蕩培養(yǎng)至A600為0.5左右時，取培養(yǎng)的菌液12 ml，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)，分別于2 h、4 h、6 h、8h吸取菌液3 ml，按1.2.4的方法進行樣品處理和分析。

1.2.6包涵體的復(fù)性及純化將表達菌以1∶1 000轉(zhuǎn)接1 L LB培養(yǎng)液，震蕩培養(yǎng)至A600值為0.5左右時，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達6 h，離心收集表達菌體，按20 ml/g加入超聲裂解液重懸，超聲破碎細菌(直徑2 mm變幅桿，工作3 s，停5 s，8 min一個循環(huán)，冰浴裂解)后，收集上清和沉淀，10% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色顯示融合蛋白以包涵體的形式進行表達。用包涵體洗滌液(1% TritonX-100，尿素1 mmol/L，EDTA 1 mmol/L，NaCl 0.3 mol/L)洗滌沉淀3次;然后以包涵體溶解液(ml)∶菌體濕重(g) = 15∶1的比例加包涵體溶解液(Tris-HCl 20 mmol/L，2%TritonX-100，NaCl 0.5 mol/L，DTT 0.2 mmol/L，尿素8 mol/L)重懸包涵體，4℃搖床緩慢震蕩溶解3～4 h后離心取上清采用透析復(fù)性法進行透析，分別以尿素濃度4、3、2.5、2、1.5、1.0、0.5 mol/L進行梯度透析，透析過程在4℃進行，每個濃度的透析時間為4 h，同時密切觀察有無渾濁或絮狀物析出，如有及時4℃20 000 r/min、30 min超速離心去除析出蛋白繼續(xù)復(fù)性。復(fù)性結(jié)束后將透析袋內(nèi)的液體10 ml與500 μl洗滌后的谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合成均勻懸液，4℃輕搖4 h; 4℃2 000 r/min離心5 min后棄上清;沉淀加入5倍床柱體積的PBS，顛倒混勻以洗去未結(jié)合的雜蛋白，4℃2 000 r/min離心5 min后棄上清，共進行3次。后加入等床柱體積的洗脫緩沖液(Reduced glutathione 10 mmol/L，Tris-HCL 50 mmol/L，NaCl 150 mmol/L)重懸勻漿，室溫孵育10 min; 2 000 r/min離心5 min，保留上清，共洗脫三次合并3次所得上清。取超聲裂解上清及不同濃度尿素洗滌、純化的上清行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的表達形式及融合蛋白純化的最佳方案。

1.2.7 Western blot法檢測融合蛋白蛋白純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將融合蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，明膠室溫封閉1 h，加入抗GST抗體，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次10 min，再加入HRP標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

2　結(jié)果

2.1人NRP-1基因的克隆和克隆載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，見一約1.8 kb的條帶，與目的基因的大小相符(圖1A)。使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ單酶切初步鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCR-blunt-NRP-1，1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見大小約1.8 kb及3.5 kb兩條清晰條帶，與理論值相符(圖1B)。

2.2融合蛋白表達載體pGEX-4T-1-NRP-1構(gòu)建及鑒定使用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pCR-blunt-NRP-1及pGEX-4T-1質(zhì)粒后，用T4 DNA連接酶連接后酶切鑒定，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳可見大小約4.9 kb及1.8 kb的兩條條帶，結(jié)果如下，與理論值相符(圖2)。

圖1　 NRP-1基因片段的擴增及pCR-blunt-NRP-1重組質(zhì)粒的酶切Fig．1 Fragment NRP-1 amplified by PCR and recombinant plasmid digested with restriction enzyme

Note: M.1 kb DNA marker.Recombinant plasmid pGEX-4T-1-NRP-1digested by BamHⅠand EcoRⅠ.

圖3　 GST-NRP-1融合蛋白的表達分析Fig．3 　Analysis expression of GST-NRP-1 protein in E.coli

2.3融合蛋白GST-NRP-1的誘導(dǎo)表達收集IPTG誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后的菌液及超聲裂解后上清和沉淀，進行考馬斯亮藍染色檢測。結(jié)合GST及NRP-1的分子量大小，融合蛋白的分子量符合理論值大小。結(jié)果顯示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后GST-NRP-1融合蛋白以包涵體的形式高表達(圖3)。

2.4不同誘導(dǎo)劑濃度對GST-NRP-1融合蛋白表達量的影響將表達菌pGEX-4T-1-NRP-1劃板培養(yǎng)并在Ampr瓊脂平板上挑選單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩至A600為0.6左右，誘導(dǎo)時間為6 h，誘導(dǎo)溫度為37℃的條件下，誘導(dǎo)劑IPTG濃度在0.1～1.0 mmol/L的范圍內(nèi)，目的蛋白表達量在0.4 mmol/L IPTG濃度時表達量最高(圖4)。

2.5不同誘導(dǎo)時間對GST-NRP-1融合蛋白表達量的影響誘導(dǎo)劑濃度為0.4 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37℃的條件下，誘導(dǎo)時間在2、4、6、8 h時，目的蛋白表達量隨著時間的延長而增加，誘導(dǎo)時間在6 h時蛋白表達量達到最高，之后趨于穩(wěn)定(圖5)。

2.6包涵體的復(fù)性及純化包涵體洗滌、溶解及透析法復(fù)性后，與GST-beads結(jié)合，經(jīng)谷胱甘肽洗脫后行考馬斯亮藍染色，結(jié)果顯示有融合蛋白的表達且純度尚可(圖6)。

Note: M.Protein molecular weight marker; 1.The bacteria before induced by IPTG; 2-6.IPTG concentration were 0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mmol/L.

Note: M.Protein molecular weight marker; 1.The bacteria before induced by IPTG; 2-5.Induction time were 4 h，6 h，8h，10h.

圖6　包涵體的復(fù)性及純化Fig．6 Inclusion body refolding and purification

圖7　融合蛋白的western blot分析Fig．7 Western blot analysis of GST-NRP-1 fusion protein

2.7 GST-NRP-1融合蛋白的檢測收集經(jīng)純化后的蛋白，經(jīng)Western blot檢測，結(jié)果證實有GSTNRP-1融合蛋白的表達(圖7)。

3　討論

NRP-1是位于染色體10p12基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白，為VEGF和SEMA家族受體。NRP-1在胚胎的骨骼肌和心血管系統(tǒng)，成人的上皮細胞、成骨細胞、骨髓干細胞以及其他組織包括肺、心臟、肝臟、腎臟、胰腺、胎盤等均有表達，在血管生成和血管發(fā)展方面起到重要作用［4］。有研究顯示敲除NRP-1的老鼠因機能不全和血管形成滯后導(dǎo)致胚胎死亡［5］。對NRP-1的研究也涉及到許多腫瘤，包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤等。Gray等［6］發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞系PANC-1中NRP-1過表達可抑制腫瘤生長，其機制與抑制AKT及Erk-1/2的磷酸化有關(guān)。通過其特異性siRNA下調(diào)NRP-1的表達，可導(dǎo)致腫瘤細胞的遷移及生長。但有研究卻發(fā)現(xiàn)NRP-1高表達可促進腫瘤的生長、內(nèi)皮細胞的增殖及血管的生成［7-10］?？筕EGF的靶向藥物貝伐單抗可延長腫瘤的進展時間，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中被廣泛使用。然而，近來許多研究已經(jīng)顯示，貝伐單抗和細胞毒性化療藥物聯(lián)合使用不增加病人的生存期，其具體機制不詳［11］。作為VEGF165受體的NRP-1，在NRP-1陽性、VEGFR2陰性的乳腺癌細胞株中，VEGF165通過激活PI3K通路阻止腫瘤細胞凋亡，而且NRP1的水平和細胞生存直接相關(guān)［12］。另外，在介導(dǎo)乳腺癌遷移和轉(zhuǎn)移中NRP1也起了非常重要的作用。有研究顯示NRP-1和VEGF是獨立的預(yù)后因素［13］，因此NRP-1的具體作用機制仍有待研究。

本研究成功構(gòu)建了攜帶NRP-1基因的原核表達載體pGEX-4T-1-NRP-1，轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞后表達了GST-NRP-1融合蛋白，該蛋白為后續(xù)進行GST-pull down實驗及質(zhì)譜分析深入研究NRP-1的作用機制及與其招募蛋白間的相互作用提供了有力工具。后續(xù)工作使用質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)組學(xué)手段結(jié)合免疫共沉淀和共定位等進一步驗證手段可望基本闡明NRP-1的功能，將有助于深入認識NRP-1對癌癥的調(diào)控機制，為后續(xù)的治療提供新的思路。

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［收稿2014-12-20修回2015-08-21］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．016

作者簡介:韓正祥(1974年－)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤方面研究，E-mail: cnhzxyq@ 163．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1370-05

文獻標志碼A

中圖分類號R73