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模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的初步篩選與鑒定①

王湘豫黃釗霞侯曉睿朱平富寧劉北一
(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣州510515)

［摘要］目的:利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)篩選并鑒定可模擬金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁脂磷壁酸(LTA)的表位。方法:以抗LTA單抗為靶分子，采用液相法對(duì)噬菌體12線(xiàn)性肽庫(kù)進(jìn)行3輪淘選，夾心ELISA鑒定噬菌體克隆。對(duì)陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序并推導(dǎo)氨基酸序列，選擇優(yōu)勢(shì)序列合成線(xiàn)性肽，ELISA鑒定線(xiàn)性肽與抗體結(jié)合特異性。結(jié)果:經(jīng)過(guò)三輪液相篩選，得到4個(gè)與抗LTA單抗特異性結(jié)合的陽(yáng)性噬菌體克隆，序列分析顯示陽(yáng)性克隆展示4種不同序列。選擇與單抗結(jié)合最好的序列GHxDFRQxxQPS合成線(xiàn)性短肽L2，ELISA結(jié)果顯示L2能夠與抗LTA單抗特異性結(jié)合。結(jié)論:利用噬菌體展示肽庫(kù)篩選技術(shù)獲得可模擬LTA表位的序列。

［關(guān)鍵詞］金黃色葡萄球菌;噬菌體展示肽庫(kù); LTA;模擬肽

①本文受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金(31270980)和廣東省自然科學(xué)基金(S2012010009562)資助。

Screening and identification of peptide mimics to lipoteichoic acid by phage displayed random peptide library

WANG Xiang-Yu，HUANG Zhao-Xia，HOU Xiao-Rui，ZHU Ping，F(xiàn)u Ning，LIU Bei-Yi.Department of Immunology，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

［Abstract］Objective: To screen epitope mimics to lipoteichoic acid from a random 12-mer phage display peptide library and identify the specificity of the mimotopes of LTA.Methods: The monoclonal antibody against LTA was used as a target to screen the 12-mer phage display peptide library and the specificity of phage clones were identified by sandwich ELISA.The amino acid sequences of positive phage clones were deduced from DNA sequencing.The specificity of synthetic peptide were identified by sandwich ELISA.Results: 4 clones were obtained after 3 rounds of screening.Amino acid sequence analysis revealed four different types of mimotope sequence.A linear peptide (GHxDFRQxxQPS)，named L2，which derived from positive sequence was synthesized.ELISA result indicates that L2 can bind to anti-LTA mAb specifically in a dose-dependent manner.Conclusion: The mimotopes of LTA were obtained by using the phage display technology.

［Key words］Staphylococcus aureus; Phage display peptide library; Lipoteichoic acid; Mimic peptide

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是一種寄居于人體皮膚和黏膜的革蘭氏陽(yáng)性(G+)菌，是社區(qū)和院內(nèi)感染的主要病原體之一［1］，除引發(fā)皮膚和軟組織感染［2］，還可引發(fā)威脅生命的肺炎、骨髓炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和膿毒血癥等［3］。近年來(lái)由于抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥程度日趨嚴(yán)重，尤其是耐甲氧西林和耐萬(wàn)古霉素的超級(jí)菌株的出現(xiàn)，給臨床治療帶來(lái)極大困難。2013年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌中甲氧西林耐藥株的平均檢出率高達(dá)45.2%［4］。面對(duì)上述嚴(yán)峻形勢(shì)，針對(duì)金葡菌的疫苗和免疫學(xué)治療研究受到關(guān)注。然而目前尚無(wú)有效疫苗可預(yù)防金葡菌感染［5-7］，主要原因之一是金葡菌致病因子眾多，不同致病因子在感染不同階段表達(dá)并發(fā)揮不同作用［8］。因此尋找穩(wěn)定表達(dá)于細(xì)菌表面的分子，以此作為構(gòu)建聯(lián)合疫苗的靶點(diǎn)成為現(xiàn)階段研究方向［9］。

脂磷壁酸LTA(Lipoteichoic acid)是金葡菌上一保守性結(jié)構(gòu)。由磷酸二酯鍵連接的磷酸甘油殘基與1個(gè)膜載體共價(jià)連接的線(xiàn)性聚合物［10］。LTA是G+菌保守結(jié)構(gòu)，無(wú)種屬特異性，LTA不僅表達(dá)于金葡菌表面，還廣泛存在于鏈球菌、糞球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁表面。LTA除維持細(xì)菌細(xì)胞壁完整結(jié)構(gòu)外［11，12］，還是細(xì)菌表面重要黏附分子，參與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用［7］，誘發(fā)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧、NO、酸性水解酶和防御素等［13］。研究表明LTA在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮起著重要作用［14-16］。他們可被TLR2識(shí)別，并能與CD14分子結(jié)合，從而活化單核細(xì)胞釋放大量促炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)感染性休克和多器官功能衰竭［17］，然而LTA為非胸腺依賴(lài)性抗原(TI抗原)，免疫原性弱，難以引起有效的再次抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本研究中以液相法篩選噬菌體肽庫(kù)，獲得模擬LTA表位陽(yáng)性序列，為后續(xù)構(gòu)建針對(duì)金葡菌保守結(jié)構(gòu)LTA的肽類(lèi)疫苗候選提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)(Ph.D.-12TMPhage display peptide library kit)，1×1013pfu/ml，購(gòu)自New England Biolabs公司，受體菌為大腸桿菌E coli ER2738。蛋白G珠(protein G beads)購(gòu)自Santa Cruz，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗M13抗體(HRP-抗M13抗體)購(gòu)自GE Heathcare公司，金黃色葡萄球菌脂磷壁酸LTA(Lipoteichoic acid )購(gòu)自Sigma公司，抗LTA單抗購(gòu)自pierce公司，HRP-鏈酶親和素Streptavidin購(gòu)自Jackson ImmunoResearch，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司和廣州斯佳生物技術(shù)有限公司，吐溫-20(Tween-20)、聚乙二醇8000(PEG-8000)購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心。

1.2方法

1.2.1噬菌體肽庫(kù)篩選采用液相篩選法。具體操作步驟如下:蛋白G珠與TBS(含0.1%Tween)輕柔懸勻，低速離心后去上清，以5 mg/ml BSA于4℃封閉60 min。5 μl噬菌體線(xiàn)性12肽庫(kù)、50 μl 100 μg/ml抗LTA單抗及145 μl 0.1%TBST混勻室溫孵育20 min。蛋白G珠封閉后，以0.1%TBST洗滌4次，將噬菌體與抗體混合物轉(zhuǎn)入已洗滌的蛋白G珠中，輕柔混勻，室溫繼續(xù)孵育15 min。0.1%TBST洗滌10次，去上清加入含1 mg/ml BSA的0.2 mol/ L Gly-HCl(pH2.2)洗脫液，室溫孵育10 min后低速離心，留取上清立即加入150 μl 1 mol/L Tris-HCl (pH9.1)進(jìn)行中和。將第一輪洗脫產(chǎn)物侵染ER2738、測(cè)滴度、擴(kuò)增純化后，用于下一輪篩選。第2、3輪篩選除將洗液改為0.5%TBST以外，其余步驟同第一輪篩選。完成3輪篩選后，測(cè)定噬菌體滴度并隨機(jī)挑取藍(lán)色噬斑制備噬菌體原種用于鑒定。

1.2.2噬菌體克隆鑒定以pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗LTA單抗至5 μg/ml，50 μl/孔，4℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板，0.25%酪蛋白37℃封閉2 h，0.5%PBST洗板3次后加入50 μl噬菌體原種上清或10倍系列稀釋陽(yáng)性噬菌體克隆No.2，37℃孵育40 min。0.5%PBST洗板10次，加入HRP-抗M13單抗(應(yīng)用時(shí)1∶3 000稀釋)，37℃孵育40 min，TMB室溫避光顯色，2 mol/L硫酸終止。以O(shè)D450nm值高于陰性對(duì)照3倍以上作為陽(yáng)性噬菌體克隆。

1.2.3 DNA測(cè)序及序列分析擴(kuò)增陽(yáng)性噬菌體克隆，按常規(guī)方法提取噬菌體單鏈DNA。樣品送上海英濰捷基公司測(cè)序。

1.2.4選擇優(yōu)勢(shì)序列合成模擬LTA抗原表位的線(xiàn)性短肽選擇與抗LTA單抗結(jié)合良好的No.2號(hào)所展示序列GHxDFRQxxQPS，委托深圳瀚宇有限公司合成線(xiàn)性肽L2(Biontin-HSGHxDFRQxxQPSGGGS )，HS、GGGS為兩端起延長(zhǎng)和支架作用的氨基酸殘基。

1.2.5 ELISA鑒定LTA模擬短肽與抗LTA單抗結(jié)合特異性抗LTA單抗以碳緩(pH9.6)稀釋?zhuān)? μg/ ml包被酶標(biāo)條，4℃過(guò)夜。0.25%酪蛋白37℃封閉2 h后，依次加入系列稀釋?zhuān)锼貥?biāo)記的線(xiàn)性肽L2(以1 mg/ml起始)，37℃孵育1 h后，加入HRP-鏈酶親和素Streptavidin(1∶1 000稀釋)，37℃孵育40 min，TMB室溫避光顯色，2 mol/L硫酸終止，測(cè)OD450nm。每個(gè)反應(yīng)間均以0.05%PBST洗滌3次。

2　結(jié)果

2.1三輪液相篩選回收率以抗LTA單克隆抗體為靶標(biāo)，采用液相篩選法篩選噬菌體12肽庫(kù)。經(jīng)3輪篩選，噬菌體富集率達(dá)300倍，富集效果明顯(表1)。所得噬菌體克隆可用于鑒定。

2.2噬菌體克隆與抗LTA單抗特異性結(jié)合隨機(jī)挑選45個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行鑒定，得到8個(gè)噬菌體克隆與抗LTA單抗結(jié)合(圖1A)。選擇其中與單抗結(jié)合最好的No.2號(hào)噬菌體克隆純化，10倍系列稀釋?zhuān)珽LISA鑒定其與抗LTA單抗結(jié)合，該克隆與抗體呈劑量依賴(lài)方式結(jié)合(圖1B)。上述結(jié)果提示液相篩選可以獲得模擬LTA表位的噬菌體克隆。

2.3陽(yáng)性噬菌體克隆DNA測(cè)序及氨基酸序列推導(dǎo)

選擇與抗LTA單抗結(jié)合良好的4個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆送出測(cè)序，根據(jù)DNA序列推導(dǎo)出4條完全不同的氨基酸序列(表2)。

表1　液相法篩選噬菌體肽庫(kù)回收率Tab．1 Measurement of recovery ratio after each round of solution-phase painning

Note: A.Positive phage clones bind to anti-LTA McAb specifically; B.Phage clone No.2 binds to anti-LTA McAb with a dose-dependent manner.

2.4線(xiàn)性肽L2與抗LTA單抗特異性結(jié)合基于No.2噬菌體克隆與抗LTA單抗結(jié)合，我們合成兩條線(xiàn)性肽L2 (Biotin-HSGHxDFRQxxQPSGGGS)和L2-1(GHxDFRQxxQPSGGGS-己二胺-Biotin)。L2和L2-1核心序列(GHxDFRQxxQPS)均來(lái)自于No.2噬菌體克隆，為便于檢測(cè)，分別將生物素標(biāo)記在L2肽N端和L2-1肽C端，其中在L2-1肽和生物素之間加入己二胺(便于在合成肽C端交聯(lián)生物素)。結(jié)果顯示，L2與抗LTA單抗呈劑量依賴(lài)方式結(jié)合(圖2A)，而在相同濃度下，L2-1不與抗LTA單抗結(jié)合(圖2B)。上述結(jié)果提示L2模擬LTA表位。

表2　液相法篩選所得陽(yáng)性噬菌體克隆氨基酸序列Tab．2 Amino acid sequences of positive phage clones screened by solution-phase biopanning

圖2　線(xiàn)性肽L2與抗LTA單抗特異性結(jié)合Fig．2 Linear peptide L2 binds to anti-LTA McAb specifically

3　討論

目前金葡菌疫苗研究難題之一在于該病原體致病因子眾多，不同臨床分離株所表達(dá)致病因子不同，而且不同致病因子在感染不同階段表達(dá)。因此有必要選擇多個(gè)穩(wěn)定表達(dá)于細(xì)菌表面的分子構(gòu)建多價(jià)疫苗。支持這一理論的是近期Bagnoli F.等構(gòu)建五價(jià)疫苗免疫后可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，并在不同感染模型中具有保護(hù)作用［9］。

我們選擇金葡菌中保守性結(jié)構(gòu)PGN和LTA作為疫苗研究候選，然而這兩個(gè)分子均屬于TI抗原，因其免疫原性弱而并不能成為疫苗。模擬肽可以作為糖脂類(lèi)抗原替代物，免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)記憶性免疫應(yīng)答［18］，模擬肽疫苗候選已用于多種病原體實(shí)驗(yàn)性疫苗研究［19，20］。我們?cè)谇捌诠ぷ髦型ㄟ^(guò)肽庫(kù)篩選獲得多條模擬PGN表位序列，根據(jù)其中一條序列合成四分支多價(jià)抗原肽MAP-P31，以此抗原肽作為免疫原免疫小鼠后，可保護(hù)小鼠抵御金葡菌感染［21］。在此基礎(chǔ)上，本研究以抗LTA單抗為靶標(biāo)篩選噬菌體肽庫(kù)以期獲得模擬LTA表位。為后續(xù)構(gòu)建PGN模擬肽與LTA模擬肽雙價(jià)疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

噬菌體肽庫(kù)篩選包括固相法和液相法，前者以靶標(biāo)蛋白直接包被后進(jìn)行肽庫(kù)篩選，方法簡(jiǎn)單;后者基于蛋白A/G株可結(jié)合靶標(biāo)分子IgG，則采用先將IgG與肽庫(kù)在液相中孵育，再通過(guò)與蛋白A/G結(jié)合后淘洗、去掉未結(jié)合噬菌體克隆。液相篩選法與固相篩選法相比優(yōu)勢(shì)在于避免得到非特異性吸附酶標(biāo)板的克隆。我們?cè)鴩L試以固相法篩選噬菌體肽庫(kù)，但回收率低，所得克隆中含非特異吸板克隆(數(shù)據(jù)未顯示)。因此在本研究中我們采用液相篩選法，表1顯示經(jīng)三輪液相篩選，回收率逐輪提高;而且ELISA結(jié)果顯示我們所獲得陽(yáng)性噬菌體克隆與LTA單抗結(jié)合，而不與酶標(biāo)板反應(yīng)(圖1A)。上述結(jié)果說(shuō)明液相篩選可行性。我們所關(guān)注的No.2克隆所展示序列GHxDFRQxxQPS與固相篩選所得陽(yáng)性克隆僅相差一個(gè)氨基酸，根據(jù)其序列所合成L2肽與抗LTA抗體特異結(jié)合，提示該序列模擬LTA表位。這為后續(xù)構(gòu)建雙價(jià)合成肽疫苗提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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［收稿2015-05-26修回2015-07-10］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．015

通訊作者及指導(dǎo)教師:劉北一(1969年－)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事抗感染免疫和疫苗研究，E-mail: lbydodo@ 163．com。

作者簡(jiǎn)介:王湘豫(1989年－)，女，主要從事抗感染免疫研究，E-mail: wxyjj_47@ 163．com。

文章編號(hào)1000-484X(2015) 10-1366-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類(lèi)號(hào)R392.9