張　濤　孟　欣　朱　濤　劉　正張立平郝杰清(天津科技大學，天津300457)

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3型肺炎球菌莢膜多糖結合疫苗的研制

張濤孟欣朱濤劉正①張立平①郝杰清①(天津科技大學，天津300457)

［摘要］目的:研制3型肺炎球菌莢膜多糖-CRM197結合疫苗。方法:將3型肺炎球菌的莢膜多糖與蛋白CRM197通過化學方法偶聯(lián)結合，制備成多糖蛋白結合疫苗并使用該疫苗免疫幼小鼠。結果:經過實驗條件的考察，發(fā)現在85℃，0.2 mol/L乙酸水解處理多糖1 h，活化度為10.0，投料比為20∶10時制得的疫苗，在小鼠體內產生了高滴度的抗體。結論:該實驗條件下制備的結合疫苗保留了完好的抗原性，以本工藝條件制備3型肺炎球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗是可行的。

［關鍵詞］3型肺炎球菌莢膜多糖;結合疫苗;鋁佐劑;免疫原性

①天津康希諾生物技術有限公司，天津市呼吸道細菌重組及結合疫苗企業(yè)重點實驗室，天津300457。

Preparation of Streptococcus pneumonia type 3 capsular polysaccharide conjugate vaccine

ZHANG Tao，MENG Xin，ZHU Tao，LIU Zheng，ZHANG Li-Ping，HAO Jie-Qing.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China

［Abstract］Objective: To prepare Streptococcus pneumonia type 3 capsular polysaccharide conjugate vaccine.Methods: Streptococcus pneumonia type 3 capsular polysaccharide was covalently linked to protein CRM197 and its immunogenicity was evaluated in infant mice.Results: Through the preliminary research，we found that the polysaccharide was treated with 0.2 mol/L acetic acid at 85℃for 1 h，activation grade reached to 10.0，and the radio of polysaccharide and protein was 20∶10，could induce infant mice to produce the high titers of antibodies.Conclusion: This result shows that conjugate vaccine prepared under this condition retained intact antigenicity.It is applicable to prepare Streptococcus pneumonia type 3 capsular polysaccharide conjugate vaccine by the process conditions.

［Key words］Streptococcus pneumonia type 3 capsular polysaccharide; Conjugate vaccine; Aluminum adjuvant; Immunogenicity

肺炎球菌感染是在全球范圍內引起死亡的重要原因之一，且是肺炎、腦膜炎、中耳炎的主要病因［1］。美國有觀察資料顯示，估計每年有40～50萬人患肺炎球菌性肺炎，病死率為5%～10%。在用疫苗可預防兒童死亡的疾病中，肺炎球菌引起的疾病排名第一［2，3］。隨著抗菌素的大量使用，耐藥菌株與日俱增，醫(yī)學界再次關注疫苗的研發(fā)［4］。研究中發(fā)現抗表面的莢膜多糖能夠保護機體對抗細菌感染，那么用多糖來制備疫苗的想法自然成形［5，6］。由于多糖是非胸腺依賴性(TI)抗原，再次免疫不能使降低的抗體達到初次免疫的水平，不能誘導免疫記憶細胞的產生，且對嬰幼兒和老人幾乎沒有保護作用，而該年齡段人群是肺炎球菌感染的高危人群。但是將肺炎球菌多糖共價連接到蛋白卻使之成為胸腺依賴性(TD)抗原，能夠對嬰幼兒和老人產生抗體，免疫效果得到提高［7，8］。

2000年惠氏成功研制出7價肺炎結合疫苗，包含血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F，接種PCV7可以預防疫苗所覆蓋7種血清型所導致的IPD，約占所有IPD的80%左右。但PCV7不能預防疫苗血清型覆蓋之外的其他血清型肺炎球菌的感染［9］。2010年惠氏上市的13價肺炎結合疫苗新增包括3型在內的其他6種血清型［10］。GSK研制的肺炎結合疫苗原本計劃中有3型血清型的研究，但是最后上市的10價結合疫苗產品中放棄加入3型血清型。根據亞洲肺炎流行血清型的調查，除了7價包含的7種血清型以外，3型血清型肺炎的發(fā)病率很高，達到了6.2%［11，12］。而在我國目前肺炎結合疫苗的接種人群注射還很大程度上依賴于國外產品，成本很高，接種完成要付出幾千元的高額費用，使很多潛在患者望而卻步，起不到全民預防的作用。所以研究我國肺炎高發(fā)流行血清型結合疫苗，形成和國外產品的競爭，解決接種肺炎過程帶來的高消費問題，已刻不容緩。

因地域和個體的不同，肺炎高發(fā)血清型在各個國家和地區(qū)都存在差異。目前國內沒有自己正式上市的肺炎結合疫苗產品，所以血清型的工藝路線研究顯得格外重要。本實驗選取了在亞洲地區(qū)發(fā)病率很高的3型肺炎血清型進行工藝路線研究。3型多糖是由兩個單糖的重復單位組成:→4) -β-D-Glcp-(1→3) -β-D-Glcp A-(1→?；罨^程中，活化度的控制至關重要?；罨仁嵌嗵呛脱趸a生的醛基比例關系?；罨忍?，氧化的醛基少，不利于蛋白的結合?；罨忍。磻獎×胰菀装l(fā)生交聯(lián)。結合過程中，投料比、結合比的控制對于結合收率的影響以及免疫原型也至關重要。工藝路線的關鍵之處在于載體蛋白的選擇。本實驗選擇CRM197作為載體蛋白，CRM197是一種白喉毒素突變體，具有其全長序列，是將其第52位Gly突變?yōu)镚lu，喪失了毒素的毒性和酶活性，保留了其免疫原性，克服了類毒素作為載體蛋白因為脫毒不徹底會產生毒性的潛在危險性［13］。通過本實驗的初步研究，經過長期不同條件的優(yōu)化，將3型肺炎球菌多糖與CRM197共價偶聯(lián)，最終能夠在小鼠體內引發(fā)很好的免疫反應。

1　材料與方法

1.1實驗材料3型肺炎球菌多糖、CRM197(天津康希諾生物技術有限公司提供)，氰基硼氫化鈉(Sigma公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(Sigma公司)，96孔酶標板(通派生物科技有限公司)，氫氧化鋁佐劑(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2實驗動物BALB/c小鼠，SPF級;由具有動物生產資格證的繁育基地提供，并附帶合格證。實驗開始前2～3 d，由具有動物使用資格證的研究單位進行檢疫，淘汰檢疫不合格動物。動物體重12～14 g;同組幼小鼠體重不超過或不低于同性別動物平均體重的20%。試驗用100只，雌性小鼠。

1.3方法

1.3.1 3型肺炎多糖活化由于3型肺炎多糖黏度大，不利于活化，所以使用前，用0.2 mol/L乙酸在85℃水解預處理1 h，減小多糖分子片段，降低分子量，降低黏度，利于活化的進行。溫度降低至20℃后加入0.1 mol/L氯化鎂。再加入一定量的高碘酸鈉氧化多糖，使其在鄰位羥基處產生醛基，在23℃下避光反應19 h。反應結束后，通過100 K的膜包用純化水對活化多糖超濾10次以上。超濾結束后，在超凈臺用0.22 μm囊式過濾器過濾。然后用0.2 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液調節(jié)活化多糖pH 至6.5，加入載體蛋白使其慢慢溶解，之后，再加入25倍于3型多糖含量的蔗糖，溶解后倒入平皿冷凍凍干。

1.3.2 3型肺炎多糖和載體蛋白結合取出凍干的多糖和蛋白后，用0.1 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液溶解，然后加入7倍醛基含量的氰基硼氫化鈉，在37℃下避光反應48 h，反應結束后加入硼氫化鈉避光封閉5 h。

1.3.3結合產物的純化封閉反應結束后，可以取出適量的樣品跑膠(SDS-PAGE)初步觀察多糖和蛋白的結合結果。然后通過疏水柱純化去掉未反應的多糖片段，再用純化水通過100 K膜包超濾10次以上去掉未反應結合的蛋白，得到最后的結合產物。超濾結束后，在超凈臺下用0.22 μm囊式過濾器過濾，無菌儲備。

1.3.4多糖和蛋白的檢測采用蒽酮法檢測多糖的含量，采用Lowry法檢測蛋白含量。測得的多糖含量與蛋白含量的比值即為結合產物中多糖與蛋白的結合比。

1.3.5氫氧化鋁佐劑的配制氫氧化鋁目標濃度20.32～24.84 g/L。分別配制400 ml 0.658 mol/L氯化鋁溶液和1.577 mol/L氫氧化鈉溶液，置于65℃水浴鍋中保溫。加入200 ml純化水至燒瓶中，攪拌。然后用雙頭蠕動泵將兩種溶液泵入加水的燒瓶中，混勻，繼續(xù)攪拌30 min。將氫氧化鋁佐劑混懸液稀釋5倍，混勻，常溫下靜置待完全分層后，用蠕動泵抽取上清液1 L。用冰醋酸調pH至6.5，且相對穩(wěn)定。最后121℃滅菌30 min，結束后擰緊瓶蓋，室溫或2～8℃保存。

1.3.6疫苗的配制樣品的緩沖液為生理鹽水和5 mmol/L pH5.8琥珀酸(已經121℃，30 min高壓滅菌)。每個實驗組需準備9 ml樣品，3 ml/瓶。其中多糖濃度為5 μg/ml，pH5.8，已經使用0.22 μm濾膜過濾無菌。

1.4疫苗接種

1.4.1免疫分組BALB/c小鼠在動物房飼養(yǎng)2～3 d后挑選檢疫合格的小鼠100只，按照檢疫期結束時動物體重均衡性原則分組。本實驗共設10組，每組10只BALB/c小鼠，雌性，第十組為陰性對照組。

1.4.2免疫流程兩周免疫一次，共免疫3次，三免前每只小鼠單獨采集二免血，三免結束后采集全血(見表1)。血樣處理和測定:取血后將血樣立即放入含有肝素鈉的Eppendorf管中，溫和顛倒幾次，水浴中暫存，2 h內低溫4℃條件下8 000 r/min離心6 min，分離血清，放置于－20℃保存，避免反復凍融。

1.5 ELISA法檢測抗體

1.5.1包被將3型肺炎球菌純化多糖抗原用包被液稀釋至10 μg/ml，每孔加入100 μl包被酶標板，4℃過夜。

1.5.2洗滌棄去包被液，每孔加入洗滌液200 μl，靜置洗滌5 min甩干，此過程重復3次，拍干。

1.5.3封閉每孔加入200 μl 1% BSA封閉1 h，同1.5.2過程重復3次后拍干。

1.5.4加樣在96孔酶標板上橫向加入待測稀釋好的血清，每孔100 μl，進行倍比稀釋，以1% BSA作為空白對照，37℃孵育1 h，孵育結束后，同1.5.2洗滌3次，拍干。

1.5.5加入酶標抗體每孔加100 μl一定稀釋度的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體，37℃孵育1 h，孵育結束后，同1.5.2洗滌6次后拍干。

1.5.6顯色加TMB顯色液100 μl，避光顯色10～15 min。

1.5.7終止每孔加終止液2 mol/L濃硫酸50 μl終止反應。

1.5.8檢測使用酶標儀在450 nm下測定吸光度。

2　結果

2.1高碘酸鈉的消耗實驗在活化過程中，跟蹤觀察高碘酸鈉隨時間的消耗情況。圖1是在85℃多糖水解0.5、1.0、1.5 h三個處理條件下在活化反應中高碘酸鈉的消耗情況:

圖1中可以根據OD280得知NaIO4的濃度。圖2中我們可以發(fā)現，在初始情況下，水解0.5 h多糖溶液中高碘酸鈉OD值最低，水解1.0 h多糖溶液中OD值居中，水解1.5 h多糖溶液中高碘酸鈉OD值最高，說明水解時間長的多糖消耗高碘酸鈉的能力較弱。隨著時間的進行，三條曲線逐漸降低，高碘酸鈉逐漸被消耗，在16 h以后OD值基本不再發(fā)生變化。所以23℃反應19 h是可行的。

2.2不同高碘酸鈉濃度對多糖活化度的影響從圖3我們可以看出，隨著高碘酸鈉濃度的增加，多糖活化表位產生的醛基數量在增加，多糖活化度在隨之降低。選取合適的活化度成為活化過程關鍵所在。

表1　疫苗接種動物實驗方案Tab．1 Experiment plan of animal vaccination

圖1　 NaIO4濃度和OD280nm的關系曲線Fig．1 Relationship between NaIO4concentration and OD280nm

圖2　 NaIO4濃度變化和反應時間的關系曲線Fig．2 Relationship between NaIO4concentration and reaction time

圖3　高碘酸鈉濃度和活化度(DO)走勢關系Fig．3 Relationship between NaIO4reaction concentration and DO

圖4　活化度對工藝中回收率的影響Fig．4 Relationship between process recovery and DO

圖5　不同投料比條件下結合產物SDS-PAGE分析Fig．5 SDS-PAGE analysis of different feed ratio conditions

2.3不同多糖活化度的對比實驗從圖4可以看出，活化過程中活化度對多糖的回收率沒有很明顯的差異。在結合過程中，活化度很小的時候，反應劇烈，發(fā)生交聯(lián)，所以回收率處于0點，隨著活化度的升高，回收率有升高的趨勢?；罨仍龃?，多糖活化的醛基位點就少，不利于蛋白的結合，所以在活化度10以后有個很明顯的下降趨勢。所以我們初步選擇活化度10為最優(yōu)點。

2.4投料比對結合反應的影響結合反應中，分別加入20∶10、10∶5、15∶5、20∶5、10∶2.5不同投料比的多糖和蛋白，觀察初步結果，上樣量為10 μg蛋白，如圖5所示:膠圖泳道上方即為結合產物。從膠圖中可以看出投料比20∶10的初步結合情況最好，在60附近的條帶較少，幾乎沒有游離蛋白，而10∶5、15∶5、20∶5的游離蛋白相對較多，10∶2.5的結合產物相對較少，所以結合反應中初步選擇20∶10投料比。

表2　不同水解處理結合疫苗免疫原性Tab．2 Immunogenicity of different hydrolysis conjugates

表3　不同活化度結合疫苗免疫原性Tab．3 Immunogenicity of different DO conjugates

2.5多糖不同水解條件對免疫原性的影響在對多糖的預處理中，通過對水解時間和溫度的篩選，使用高碘酸鈉的氧化，之后與載體蛋白結合，配制成疫苗，考察制備條件對最終免疫原性的影響，免疫實驗的結果如表2所示:前四組為不同時間的水解處理，后四組為不同溫度的水解處理。前四組可以看到隨著在85℃下時間的增加，結合比逐漸降低，但是在1 h的免疫效價最高，達到3.93。選定水解處理時間1 h后，后四組研究不同溫度的影響。隨著溫度的升高，結合比沒有明顯的變化趨勢，免疫原性逐漸升高。85℃和95℃免疫原性幾乎沒有差別?？紤]到對多糖抗原原始分子結構的保護，我們選擇85℃下水解處理1 h做為最優(yōu)條件。

2.6活化度對免疫原性的影響活化實驗中，多糖濃度為2 g/L，考察多糖與蛋白結合比對最終免疫原性的影響，免疫的數據如表3所示:可以看出隨著活化度的減小，醛基數量的增加，結合比越來越小，結合的蛋白越來越多，并且效價呈現出上升的趨勢。免疫原性沒有太大區(qū)別，都維持在4左右?？紤]到多糖原始結構免疫原性，所以我們選擇活化度為10左右作為最優(yōu)活化度。

3　討論

肺炎莢膜多糖的血清型很多，根據多糖抗原免疫機制的需要、化學性質以及載體蛋白的不同，每種血清型都有適合自己的結合方法。結合疫苗的結合化學主要是指根據莢膜多糖和所選載體蛋白的性質，在保證多糖抗原的抗原決定簇(抗原表位、特異性基團)不被破壞，免疫原性以及免疫反應性不受影響的基礎上，選擇合適的結合方式進行結合。實質就是通過一定的化學反應或借助連接劑將多糖抗原和載體蛋白連接在一起。多糖的修飾和活化程度，分子量的大小，特異性基團的多少，結合方式，與載體蛋白的結合比例，交聯(lián)程度，結合產物分子量的大小，結合產物中游離多糖的含量等很多因素都會影響到結合疫苗的免疫原性。因此對工藝步驟的各個階段進行質量監(jiān)督是十分必要的。

隨著結合疫苗價數和載體蛋白劑量的增加，結合物之間或共免疫抗原之間產生干擾的可能性就越大。解決這一問題需要對免疫干擾的機制進行更深入的研究，應用不同載體來結合莢膜多糖是一種可行的方法。肺炎球菌表面蛋白A (PspA)廣泛存在于90多種肺炎球菌的血清型中，在以PspA為載體應用于肺炎結合疫苗中，PspA發(fā)揮載體作用的同時，還對肺炎球菌具有免疫保護。這樣不僅可以增大血清型的覆蓋率，同時也防止在大量的商業(yè)疫苗過度使用中由于相同蛋白而引發(fā)的免疫應答功能障礙。研究者還以沙門菌為載體，構建了傳遞多種Pn蛋白抗原的沙門菌疫苗，并證實這種疫苗經口服免疫能誘導保護作用［7，14］。

3型肺炎鏈球菌在我國屬于導致肺炎頻率較高的病原體，所以針對地區(qū)選擇高發(fā)血清型進行研究顯得格外重要［15］。目前市場肺炎球菌結合疫苗包含的血清型均是參照西方發(fā)達國家的流行病學資料，對于其他血清型沒有相應的預防作用。地域和個體的不同，血清型的地理分布限制了疫苗發(fā)揮的最大作用。發(fā)展中國家在疫苗引進及開發(fā)過程中還需要進一步完善本地區(qū)的流行病學資料，使得所開發(fā)的疫苗最大限度的覆蓋本地區(qū)優(yōu)勢發(fā)病血清型，同時密切關注疫苗可能導致肺炎球菌引起疾病的主要血清型發(fā)生明顯轉換，采取更合理的免疫預防策略，達到最佳免疫預防效果。

此外肺炎結合疫苗研究成本較高，使其在發(fā)展中國家的應用受到限制。發(fā)展中國家的肺炎感染占有很大的比重，要想起到全球預防的作用，降低成本，使其成為絕大多數人可以承擔起的商品顯得尤為重要，這樣才能更好地預防肺炎球菌感染的傳播。

本實驗選用CRM197作為載體蛋白，通過在水解溫度、水解時間、活化度以及投料比四個方面對3型肺炎球菌多糖結合疫苗的探究優(yōu)化，可以在幼小鼠體內表現出較高的免疫原性，為以后研究多價肺炎結合疫苗奠定了基礎。

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［收稿2015-03-25修回2015-04-22］

(編輯倪鵬)

·免疫學技術與方法·

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．014

通訊作者及指導教師:朱濤(1973年－)，男，博士，教授，主要從事疫苗方面的研究，E-mail: tao.zhu @ cansinotech.com。

作者簡介:張濤(1990年－)，男，主要從事肺炎結合疫苗方面的研究，E-mail: 993065503@ qq．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1361-05

文獻標志碼A

中圖分類號R186.3