朱喜玲　周文蕓張海玲　翟精武　孫翠英　?！∏铩∥摹≈楹鷩?安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安順561000)

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被動(dòng)免疫治療過敏性鼻炎豚鼠對炎癥細(xì)胞因子的影響①

朱喜玲周文蕓②張海玲翟精武孫翠英常秋文珠③胡國柱②(安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安順561000)

［摘要］目的:探討抗IL-1β和TNF-α IgY滴鼻治療過敏性鼻炎豚鼠對炎癥細(xì)胞因子的影響。方法:應(yīng)用卵清白蛋白

(OVA)建立豚鼠過敏性鼻炎模型。將豚鼠隨機(jī)分為:正常對照組(C組，17只)，模型組(M組，27只)，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組，21只)，丙酸氟替卡松治療組(Z2組，21只)。分別在治療后2、4、8 h心臟取血，鼻灌洗收集鼻灌洗液(NLF)，ELISA法測定細(xì)胞因子水平。結(jié)果:在外周血，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組2～8 h時(shí)IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-33和TGF-β1，2～4 h時(shí)TNF-α和OVA特異性IgE，以及4～8 h時(shí)IL-22等水平均顯著低于模型組(P＜0.05)。在鼻灌洗液中，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組2～8 h時(shí)IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TNF-α、TGF-β1和OVA特異性IgE，以及2 h時(shí)IL-18等水平顯著低于模型組(P＜0.05)。結(jié)論:過敏性鼻炎豚鼠采用抗IL-1β和TNF-α IgY滴鼻治療能顯著地降低炎癥因子水平。

［關(guān)鍵詞］過敏性鼻炎;豚鼠;卵白蛋白;腫瘤壞死因子;白細(xì)胞介素-1β;細(xì)胞因子

①本文為江西省科技廳社會發(fā)展重大招標(biāo)課題(2006第四批)。

②江西省人民醫(yī)院，南昌330006。

③江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院血液研究室，南昌330006。

Influence on inflammation cytokines in passive immunotherapy for allergic rhinitis guinea pigs

ZHU Xi-Ling，ZHOU Wen-Yun，ZHANG Hai-Ling，ZHAI Jing-Wu，SUN Cui-Ying，CHANG Qiu，WEN Zhu，HU Guo-Zhu.Agricultural College，Anshun College，Anshun 561000，China

［Abstract］Objective: To explore the influence on inflammation cytokines for anti-IL-1β and TNF-α IgY intranasal treatment in guinea pigs with allergic rhinitis.Methods: The allergic rhinitis model in guinea pigs was established using ovalbumin(OVA) .Hartley guinea pigs were randomly divided into the control group(group C，n = 17)，the allergic rhinitis model group(group M，n = 27)，the 0.1% anti-IL-1β and TNF-α IgY treatment group(group Z1，n=21) and the fluticasone propionate treatment group(group Z2，n=21)．At 2 h，4 h and 8 h after the last treatment，blood was got by heart puncture，as well as nose was lavaged using 0.9% saline and the nasal lavage fluid(NLF) was collected.The level of cytokines was examined using ELISA kits.Results: In the peripheral blood，the levels of IL-1β，IL-5，IL-9，IL-13，IL-18，IL-33 and TGF-β1 from 2 h to 8 h; TNF-α and OVA-specific IgE from 2 h to 4 h; and IL-22 from 4 h to 8 h were significantly decreased in the 0.1% anti-IL-1β and TNF-α IgY treatment group compared with the allergic rhinitis model group(P＜0.05) .In the NLF，the levels of IL-1β，IL-5，IL-9，IL-13，IL-22，IL-33，TNF-α，TGF-β1 and OVA-specific IgE from 2 h to 8 h; and IL-18 at 2 h were significantly decreased in the 0.1% anti-IL-1β and TNF-α IgY treatment group compared with the allergic rhinitis model group(P＜0.05) .Conclusion: Anti-IL-1β and TNF-α IgY intranasal treatment can significantly reduce inflammation cytokine levels in allergic rhinitis guinea pigs.

［Key words］Allergic rhinitis; Guinea pigs; Ovalbuamin; TNF-α; IL-1β; Cytokines

在過敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)，當(dāng)機(jī)體再次暴露于抗原2 h至24 h后即出現(xiàn)晚期反應(yīng)［1，2］。卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的過敏性鼻炎豚鼠和小鼠，及過敏性鼻炎患者其血清和鼻灌洗液中IgE、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TNF-α和嗜酸性陽離子蛋白-1水平顯著升高［1，3-8］。我們前期研究證明，抗TNF-α和IL-1β IgY顯著減少和減輕過敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和炎癥病理反應(yīng)，減少NLF中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，降低鼻黏膜IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達(dá)［9］。本文觀察抗IL-1β和TNF-α IgY滴鼻被動(dòng)免疫治療過敏性鼻炎豚鼠，探討其對炎癥因子和Th2細(xì)胞因子的影響，以期為過敏性鼻炎的臨床治療尋找新的有效途徑。

1　材料與方法

1.1材料Hartley豚鼠，雄性，7周齡，體重(200± 50) g，購自上海嚙齒類動(dòng)物研究中心，許可證號: SXCK(滬) 2012-0008?？筎NF-α和IL-1β IgY(純度85%，效價(jià)1∶3 200/mg蛋白) ;丙酸氟替卡松(濃度0.05%，英國Glaxsmithk公司) ;卵清白蛋白(Sigma公司) ;氫氧化鋁凝膠(美國Thermo scientific公司) ; IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TNF-α、TGF-β1、OVA特異性IgE ELISA試劑盒(中國上海西塘生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1豚鼠過敏性鼻炎模型建立133只豚鼠根據(jù)體重隨機(jī)分成正常對照組(C組，17只)和過敏性鼻炎模型建立組(116只)。建立豚鼠過敏性鼻炎模型方法見文獻(xiàn)［10］。簡言之，正常對照組(C組)基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫(激發(fā))均采用每側(cè)鼻孔滴注0.1 ml生理鹽水。建立過敏性鼻炎模型(116只)基礎(chǔ)致敏時(shí)腹腔注射1 ml的0.03% OVA + 3.0%氫氧化鋁，隔日1次，共7次;然后采用OVA皮內(nèi)注射法鑒定豚鼠致敏是否成功;致敏成功的豚鼠休息7 d后，采用2.0%OVA滴鼻激發(fā)3次(0.1 ml /每側(cè)鼻孔，每天1次)，然后根據(jù)豚鼠(剩余69只)過敏癥狀評分結(jié)果隨機(jī)分成模型組(M組，n = 27)，0.1 ml生理鹽水滴鼻后再滴鼻2.0%OVA激發(fā); 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組，n = 21)，0.1 ml 0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY滴鼻后再滴鼻2.0% OVA激發(fā);丙酸氟替卡松治療組(Z2組，n = 21)，0.1 ml丙酸氟替卡松滴鼻后再滴鼻2.0%OVA激發(fā);每天1次，共7次。OVA攻擊10次后M組死亡6只(剩21只)，Z1組死亡2只(剩19只)，Z2組死亡5只(剩16只)。

1.2.2鼻灌洗及鼻灌洗液收集治療結(jié)束后每組豚鼠分別在2 h、4 h或8 h時(shí)間點(diǎn)各取數(shù)只豚鼠進(jìn)行鼻灌洗及收集鼻灌洗液。鼻灌洗及鼻灌洗液收集操作參照Bahekar等人［10］方法。操作簡述如下: 10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉豚鼠，豚鼠仰頭向上并固定，小塑料管插入一個(gè)鼻孔，使用5.0 ml注射器吸取2 ml生理鹽水慢慢推注(0.1 ml/min)沖洗鼻腔，從另一個(gè)鼻孔用微量取樣器吸出鼻灌洗液(NLF)，然后離心2 500 r/min，10 min，取上清液即為NLF，儲存于－80℃。

1.2.3心臟采血治療結(jié)束后在2 h、4 h或8 h時(shí)間點(diǎn)各取數(shù)只豚鼠在鼻灌洗及收集鼻灌洗液之后，開胸暴露出心臟，使用5.0 ml注射器心臟穿刺抽血置EDTA抗凝管，離心2 500 r/min，10 min，取血漿至－80℃保存。

1.2.4細(xì)胞因子測定血漿和鼻灌洗液中IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TNF-α、TGF-β1 和OVA特異性IgE水平采用雙抗夾心ELISA法測定，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行，通過試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞因子濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用x ±s表示，各組樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA分析，若方差齊性，采用LSD法比較兩組之間差異;若方差不齊性，采用多重秩和檢驗(yàn)，多重比較采用Mann-Whiteney法，以P＜0.05表示差異有顯著性。

2　結(jié)果

2.1外周血細(xì)胞因子濃度變化在外周血，0.1% 抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時(shí)IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、L-18、IL-33、TGF-β等細(xì)胞因子，2～4 h時(shí)TNF-α和OVA特異性IgE，4～8 h時(shí)IL-22等細(xì)胞因子含量顯著低于過敏性鼻炎豚鼠模型組(M組) (P＜0.05) (表1) ; 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組)與丙酸氟替卡松治療組(Z2組)比較無顯著性差異(P＞0.05) (表1) ; 0.1% 抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時(shí)TNF-α、IL-18，2～4 h時(shí)TGF-β，4～8 h時(shí)OVA特異性IgE，2 h和8 h時(shí)IL-13，此外2 h時(shí)IL-5、4 h時(shí)IL-22、8 h時(shí)IL-9等細(xì)胞因子含量與正常對照組(C 組)無顯著差異(P＞0.05) (表1)。

2.2鼻灌洗液細(xì)胞因子濃度變化在鼻灌洗液中，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時(shí)IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TGF-β、OVA特異性IgE，2 h時(shí)IL-18等細(xì)胞因子含量顯著低于過敏性鼻炎豚鼠模型組(M組) (P＜0.05) (表2) ; 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組)與丙酸氟替卡松治療組(Z2組)比較無顯著性差異(P＞0.05)(表2) ; 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時(shí)TNF-α、IL-5、OVA-特異性IgE，2～4 h時(shí)IL-9、IL-33，2 h和8 h時(shí)IL-22，4～8 h時(shí)IL-1β，4 h時(shí)IL-13，8 h時(shí)TGF-β等細(xì)胞因子含量與正常對照組(C 組)無顯著差異(P＞0.05) (表2)。

表1　各組過敏性鼻炎豚鼠外周血炎癥細(xì)胞因子水平(x±s)Tab．1 Levels of inflammation cytokines in PB in guinea pigs with allergic rhinitis after different treatment groups(x±s)

表2　各組過敏性鼻炎豚鼠鼻灌洗液炎癥細(xì)胞因子水平(x ±s)Tab．2 Levels of inflammation cytokines in NLF in guinea pigs with allergic rhinitis after different treatment groups(x±s)

(續(xù)表2)

3　討論

OVA誘導(dǎo)的豚鼠和小鼠，以及人類過敏性鼻炎患者血清中總IgE和OVA特異性IgE、TNF-α、IL-9、IL-18、IL-22、IL-33含量顯著增加;鼻灌洗液中OVA特異性IgE、IL-5、IL-13、IL-33、IL-18、TGF-β含量顯著增加。本文也證明，OVA誘導(dǎo)的過敏性鼻炎豚鼠IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-22、IL-33、TGF-β等前炎癥因子和炎癥因子，IL-5、IL-9、IL-13等Th2細(xì)胞因子，以及OVA特異性IgE含量在外周血和鼻灌洗液中顯著增加(表1、2)。然而滴鼻給予過敏性鼻炎模型豚鼠抗IL-1β和TNF-α IgY治療后，外周血OVA特異性IgE、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、L-33、TGF-β含量顯著降低(P＜0.05) (表1)。Iwasaki等［11］也證明OVA誘導(dǎo)的過敏性鼻炎TNF-α (-/-)小鼠血清OVA特異性IgE含量減少?？笽L-33抗體治療OVA誘導(dǎo)的過敏性鼻炎小鼠也減少了血清總IgE和OVA特異性IgE含量［12，13］。本文滴鼻給予過敏性鼻炎模型豚鼠抗IL-1β和TNF-α IgY治療后，鼻灌洗液中OVA特異性IgE、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TGF-β含量顯著降低(P＜0.05) (表2)。本文研究還提示，抗IL-1β和TNF-α IgY降低炎癥因子及Th2細(xì)胞因子的療效與丙酸氟替卡松(糖皮質(zhì)激素)無顯著性差異(P＜0.05) (表1、2)。值得注意的是鼻灌洗液中IL-18含量僅僅是在治療后2 h下降，而4～8 h則高于模型組豚鼠。Salagianni等［14］發(fā)現(xiàn)IL-18起著抑制IgE產(chǎn)生的作用。在體外IL-18與IL-12輔助促進(jìn)Th1/ Tc1發(fā)展，抑制向Th2/Tc2分化。IL-18(-/-)小鼠與野生型正常小鼠比較，經(jīng)OVA免疫后IL-18(-/-)小鼠表現(xiàn)出高IgE和IgG1水平。這個(gè)結(jié)果提示，經(jīng)抗IL-1β和TNF-α IgY治療后IL-18升高可能是有利于疾病的恢復(fù)，因?yàn)槠淇赡芤种芓h2細(xì)胞因子產(chǎn)生。

TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TGF-β等細(xì)胞因子參與了過敏性炎癥病理反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，并且這些細(xì)胞因子相互作用刺激其進(jìn)一步增加，從而加重炎癥病理反應(yīng)。例如: IL-9刺激人氣道平滑肌細(xì)胞釋放Th2相關(guān)的趨化因子(eotaxin1/CCL11)［15］。哮喘患者IL-13刺激氣道纖維母細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1導(dǎo)致氣道重塑［16］。在過敏性鼻炎小鼠，IL-33刺激鼻黏膜分泌IL-4、IL-5、IL-13［17］。IL-33誘導(dǎo)IL-13產(chǎn)生的2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells)擴(kuò)增［18］。OVA與IL-1β或IL-33一道作用于OVA致敏的小鼠氣道使其產(chǎn)生IgE［19］。致敏的動(dòng)物氣道暴露于致敏原引起ATP和尿酸釋放，激活NLRP3炎癥體復(fù)合物，其裂解IL-1β原成為成熟的IL-1β［20］。人鼻黏膜纖維母細(xì)胞暴露于IL-1β或TNF-α增加了IL-33產(chǎn)生［21］，而TNF-α刺激哮喘患者的氣道平滑肌細(xì)胞上調(diào)IL-33表達(dá)［22］。Mo等［23］證明抗TNF-α處理過敏性鼻炎小鼠減輕了其過敏癥狀，降低了總的和OVA特異性IgE水平，以及減少了IL-4的產(chǎn)生。本研究的結(jié)果提示前炎癥因子IL-1β和TNF-α在過敏性炎癥病理反應(yīng)細(xì)胞因子相互作用程序中先于IL-33，并且在過敏性炎癥的炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中IL-1β和TNF-α處于細(xì)胞因子相互作用的起始端。因此，采用抗IL-1β和TNF-α IgY局部阻斷IL-1β和TNF-α能更有效地抑制過敏性炎癥病理反應(yīng)，且避免糖皮質(zhì)激素帶來的不良反應(yīng)，其可能是一種潛在而有效的生物學(xué)治療新手段。

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［收稿2015-04-17修回2015-05-13］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．012

通訊作者及指導(dǎo)教師:胡國柱(1956年－)，男，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫學(xué)研究，E-mail: hgz56@126.com。

作者簡介:朱喜玲(1988年－)，女，主要從事免疫治療學(xué)研究。

文章編號1000-484X(2015) 10-1352-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號R392