黎　奔　廖康生　徐方方　陳偉英　焦　紅劉　博(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學院，廣州510006)

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寶樂果多糖的體內免疫活性研究①

黎奔廖康生徐方方陳偉英焦紅②劉博
(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學院，廣州510006)

①本文受國家自然科學基金青年科學基金(81202398)、國家中醫(yī)藥管理局基地科研專項(JDZX2012010)、廣州市科技攻關項目(201300000147)和廣東省科技廳(2012B031800310)資助。

②廣東出入境檢驗檢疫局，廣州510623。

Studies on immune-enhancing activity of polysaccharides from Borojoa sorbilis cuter

LI Ben，LIAO Kang-Sheng，XU Fang-Fang，CHEN Wei-Ying，JIAO Hong，LIU Bo.Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences/The 2nd Affiliated Hospital of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China

［Abstract］Objective: Studies on the immune-enhancing activity of Polysaccharides from the fruits of Borojoa sorbilis cuter (polysaccharides BSCP) in vivo.Methods: 54 male BALB/c mice were randomly divided into six groups.The immune suppression mice in the three experimental groups，which were induced by cyclophosphamide (CY) at 80 mg/kg/d via intraperitoneal injection，were perfused with 100，200，400 mg/kg/d BSCP for 30 d.The effect of BSCP on cellular immune function，humoral immune function and mononuclear macrophage function were measured.Results: CY-treated mice showed a significant decrease in immune function(P＜0.05)，humoral immune function(P＜0.01) and mononuclear macrophage function(P＜0.01) .The administration of BSCP was able to overcome the CY-induced immunosuppression，treatment with BSCP-L，BSCP-M and BSCP-H groups significantly enhanced the cellular immune function(each was P＜0.05) and mononuclear macrophage function(each was P＜0.05)，and treatment with BSCP-M and BSCP-H significantly enhanced humoral immune function(each was P＜0.01) .Conclusion: BSCP could significantly increase immune responses and reduce the side effects of CY in immune system.Therefore，the BSCP could be an immunomodulatory agent.

［Key words］Borojoa sorbilis cuter polysaccharides; Immunological activities; Cyclophosphamide-induced; In vivo

天然藥物中富含多糖類成分。多糖藥理活性廣泛，且具有一定的免疫調節(jié)活性，是一類非特異性的免疫調節(jié)劑。多糖不僅能激活T、B淋巴細胞、巨噬細胞(Mφ)、自然殺傷細胞(NK)、細胞毒T淋巴細胞(CTL)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、樹突狀細胞(DC)等免疫細胞［1-4］，還能促進細胞因子生成，激活補體系統(tǒng)，促進抗體產生，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調節(jié)作用［5-7］。

寶樂果(Borojoa sorbilis Cuter.)是茜草科林果屬植物Borojoa Patinoi Cuatrec.和Borojoa sorbilis Cuatrec.的成熟果實，產于拉丁美洲厄瓜多爾的熱帶雨林?，F代藥理研究證實，寶樂果具有體外抗氧化作用，抗D-半乳糖所致小鼠衰老的作用，抗小鼠胚胎NIH/3T3細胞UVA損傷的作用［8-10］。本文開展對寶樂果多糖的體內免疫活性研究，能夠為寶樂果的應用提供科學依據，對寶樂果的深層開發(fā)利用具有一定的現實意義。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料寶樂果:新鮮寶樂果由厄瓜多爾東方食品集團提供，經廣東省中醫(yī)院黃志海研究員鑒定為茜草科林果屬植物B.sorbilis Cuatrec的成熟果實;其余試劑如無特殊說明均為國產分析純。

Hanks緩沖液，杭州吉諾; 4 %雞紅細胞，綿羊紅細胞(SRBC)，豚鼠血清，廣州蕊特生物科技有限公司; MTT，刀豆蛋白A，美國MP Biomedicals生物醫(yī)藥公司; Cyclophosphamide monohydrate，東京化成工業(yè)株式會社; Giemsa染液，南京建成生物工程研究有限公司; RPMI1640培養(yǎng)液，PBS緩沖液，美國Hyclone公司;胎牛血清，美國Gibco公司; SA緩沖液，美國Thermo公司;印度墨汁，廣州杰特偉生物科技有限公司。實驗動物: BALB/c小鼠，雄性，(20±2) g，由廣東省實驗動物中心提供，合格證號: No.44007200015109。

1.2主要儀器設備超凈工作臺;酶標儀(Vitorх5)，美國PerkinElmer公司; Count star自動細胞計數儀(IC-100)，上海睿鈺生物科技有限公司;倒置熒光顯微鏡(DMI3000)，德國Leica公司;二氧化碳培養(yǎng)箱(熱電311型)，美國Thermo Scientific公司;紫外雙光分光光度計(U-2910)，日本HITACHI公司;超純水機(Elix5)，美國MilliPore公司;電子天平(BS224S)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;高速臺式冷凍離心機(5430R)，德國Eppendorf公司等。

1.3寶樂果多糖的制備寶樂果多糖經超高壓技術提取，寶樂果在60℃下干燥至恒重后，超微粉碎，過200目篩。準確稱取一定量的寶樂果細粉，用95%乙醇浸泡過夜以除去脂溶性成分和部分色素，過濾，濾渣自然晾干后，與一定量的水充分混合后經超高壓處理后，3 000 r/min離心10 min，取上清，用95%乙醇將其濃度調至80%，靜置過夜，3 000 r/min離心10 min收集棕色沉淀，用無水乙醇充分洗滌，烘干得寶樂果粗多糖，用苯酚硫酸法測得其粗多糖中多糖的含量為76.92%，多糖的總得率為8.28%［12］。粗多糖以Sevage法和透析法去除蛋白質、小分子物質及色素等雜質而得到寶樂果多糖，紫外光譜檢測其在260 nm和280 nm，證明其結構中不含核酸與蛋白質成分，苯酚硫酸法測得其多糖含量為88.05 %。

1.4實驗動物54只雄性BALB/c小鼠(3～4周齡)，飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%的環(huán)境中，實驗過程中自由飲食。動物適應環(huán)境3 d后，隨機分為6組，每組9只。兩組正常小鼠作為正常對照組和陽性對照組，正常對照組每天灌胃相應的生理鹽水，陽性對照組每天按體重200 mg/kg灌胃寶樂果多糖水溶液。其他四組小鼠，第1、2、3、13 和23 d按體重經腹腔注射80 mg/kg環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液，陰性對照組每天灌胃相應的生理鹽水，三組給藥組每天分別按體重100 mg/kg(BSCP-L組)，200 mg/kg(BSCP-M組)，400 mg/kg(BSCP-H組)的劑量灌胃相應的寶樂果多糖水溶液。飼養(yǎng)30天，在最后一次灌胃給藥后24 h，頸椎脫臼處死。

1.5細胞免疫功能測定MTT法測定脾淋巴細胞增殖反應無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank＇s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經40 μm尼龍網過濾，用Hank＇s液洗兩次，每次離心10 min(1 000 r/min)。然后將細胞懸浮于1 ml的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數活細胞數(在95 %以上)，調整細胞濃度為3×106個/ml。將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，一孔加75 μl Con A液(相當于7.5 μg/ml)，另一孔作為對照，置5 %CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT(5 mg/ml) 50 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1 ml酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔做3個平行孔，用酶標儀，以570 nm波長測定光密度值。

1.6體液免疫功能測定

1.6.1抗體生成細胞檢測在小鼠灌胃第24天，腹腔注射0.2 ml的2 %壓積SRBC生理鹽水(v/v)細胞懸液免疫，將SRBC免疫7天后的小鼠頸椎脫臼處死，按1.5方法取脾制成單細胞懸液，將細胞濃度調整為5×106個/ml。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后，放45℃～50℃水浴保溫，與等量pH=7.2～7.4、2倍濃度的Hank's液混合，分裝小試管，每管0.5 ml，再向管內加50 μl 10% SRBC(v/v，用SA緩沖液配制)，20 μl脾細胞懸液(5×106個/ml)，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后用SA緩沖液稀釋的補體(1∶8)加入玻片架凹槽內，繼續(xù)溫育1 h后，計數溶血空斑數，用空斑數/106脾細胞來表示。

1.6.2血清溶血素的測定(血凝法)取SRBC免疫過的小鼠血清，用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內，每孔100 μl，再加入100 μl 0.5 %(v/v)的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內加蓋，于37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。血清凝集程度一般分為5級(0-Ⅳ)記錄，按下式計算抗體積數:

抗體積數=(S1+2S2+3S3……nSn)。式中1、2、3……n代表對倍稀釋的指數，S代表凝集程度的級別，抗體積數越大，表示血清抗體越高。0級，紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。Ⅰ級，紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀，四周有少量凝集的紅細胞。Ⅱ級，凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。Ⅲ級，凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。Ⅳ級，凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

1.7單核-巨噬細胞功能測定

1.7.1小鼠碳廓清實驗按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁(10 ml/kg)，待墨汁注入，立即計時，注射墨汁后2 min(t1)、10 min(t2)，分別從內眥靜脈叢取血20 μl，并立即將其加到2 ml 0.1 % Na2CO3中。用分光光度計在600 nm波長處測光密度值(OD1)，以Na2CO3溶液做空白對照(OD2)。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力，按下式計算吞噬指數a。K=(lgOD1－lgOD2) /(t2－t1) ;吞噬指數a=［體重/(肝重+脾重)］×K1/3。

1.7.2小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(滴片法)小鼠巨噬細胞的激活:實驗前4 d給每只小鼠腹腔注射2 %壓積羊血細胞0.2 ml。用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液4 ml/只，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2 ml于試管內。用1 ml加樣器吸取腹腔洗液0.5 ml 1 %雞血紅細胞懸液的試管內，混勻。用注射器吸取0.5 ml混合液，加入玻片的瓊脂圈內。放置孵箱內37℃孵育15～20 min。用蒸餾水沖洗干凈，晾干，用顯微鏡計數吞噬率和吞噬指數。吞噬率為每100個巨噬細胞中，吞噬雞紅細胞的巨噬細胞所占的百分率;吞噬指數為平均每個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的個數。

1.8統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析用SPSS13版本，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值＜F0.05，結論:各組均數間差異無顯著性; F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統(tǒng)計，對非正態(tài)或方差不齊的數據經Kruskal-Wallis H檢驗，χ2值＜χ20.05，結論:各組均數間差異無顯著性;χ2值≥χ2

0.05，P≤0.05，用秩變換技術實現多個實驗組和一個對照組均數的兩兩比較進行比較［11］。

2　結果

2.1寶樂果多糖對細胞免疫功能的影響ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗，圖1列出了寶樂果多糖對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響。陰性對照組的脾淋巴細胞轉化功能與正常對照組比較明顯降低(P＜0.05)。灌服低、中、高劑量的寶樂果多糖能顯著提高脾淋巴細胞的轉化功能，與陰性對照組相比(P＜0.05)，且呈劑效關系。陽性對照組的脾淋巴細胞的轉化功能也明顯高于正常對照組(P＜0.05)。

2.2寶樂果多糖對體液免疫功能的影響

2.2.1寶樂果多糖對抗體生成細胞的影響，圖2列出了寶樂果多糖對抗體生成細胞的影響。陰性對照組的溶血空斑數明顯低于正常對照組(P＜0.01)。給藥組(BSCP-M與BSCP-H)的溶血空白數明顯多于陰性對照組(P＜0.01)。陽性對照組的溶血空斑數也明顯多于正常對照組(P＜0.01)。

2.2.2寶樂果多糖對血清溶血素的影響圖3列出了寶樂果多糖血清溶血素的影響，寶樂果多糖能提高血清溶血素的功能(抗體積數)，與陰性對照組相比(P＜0.05)，且呈劑效關系。陽性對照組的血清溶血素功能也明顯高于正常對照組(P＜0.01)。

2.3寶樂果多糖對單核-巨噬細胞功能的影響表1列出了不同劑量的寶樂果多糖對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響情況。陰性對照組的單核-巨噬細胞功能明顯低于正常對照組(P＜0.01)。灌服不同劑量的寶樂果多糖能不同程度地增強單核-巨噬細胞的功能，與陰性對照組相比(P＜0.05)。陽性對照組的單核-巨噬細胞的功能也明顯強于正常對照組(P＜0.01)。

圖1　寶樂果多糖對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化的影響(x ±s)Fig．1 Effect of BSCP on ConA-induced transfor-mation of lymphocyte(x±s)

圖2　寶樂果多糖對抗體生成細胞的影響(x ±s)Fig．2 Effect of BSCP on antibody-producing cell(x±s)

圖3　寶樂果多糖對血清溶血素的影響(x±s) Fig．3 Effect of BSCP on hemolysin(x±s)

表1　寶樂果多糖對單核-巨噬細胞功能的影響(x ±s)Tab．1 Effect BSCP on mononuclear macrophages (x±s)

3　討論

環(huán)磷酰胺是一種有效的癌癥化療藥物，長期給藥會導致免疫抑制反應，導致紅細胞生成素的缺少而引起貧血癥［12］。而在本實驗中也證實了環(huán)磷酰胺能誘導免疫抑制反應。

T淋巴細胞受有絲分裂原Con A刺激后能發(fā)生增殖反應［13］，活細胞特別是增殖細胞中的線粒體水解酶可將MTT分解為蘭紫色結晶，其光密度值能反應細胞的增殖情況。本實驗中，BSCP能顯著地改善環(huán)磷酰胺所致的脾淋巴細胞功能低下(各為P＜0.05)，而且結果顯示，BSCP刺激T細胞的增殖作用呈良好的量效關系，其作用機制可能是增強IFN、IL-2、IFN-γ等細胞因子的活性，這些細胞因子都能夠促進T細胞增殖［14］。

正常小鼠在受動物紅細胞免疫后，可以產生特異性抗體，稱為溶血素，溶血素在有補體的情況下會裂解紅細胞，紅細胞的溶血與血清中的抗體水平有關，因此，血清里的溶血情況可反映抗體生成細胞數［15］。本實驗中，BSCP能改善環(huán)磷酰胺所致的體液免疫功能低下，提高抗體生成細胞數，目前，關于中藥多糖增強體液免疫功能的機制還不清楚，其機制有待進一步研究。

小鼠的碳廓清實驗與腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗都可反映小鼠體內單核巨噬細胞的吞噬功能，其功能在細胞免疫方面發(fā)揮著重要作用。絕大數中藥多糖都能促進巨噬細胞的吞噬功能，本實驗中，BSCP能改善環(huán)磷酰胺所致的單核巨噬細胞功能低下，其作用機制可能是BSCP能提高單核巨噬細胞的NO的分泌和先天炎性細胞因子的功能從而達到提高單核巨噬細胞的功能［16］。

綜上所述，寶樂果多糖在小鼠體內呈現出明顯的對抗環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制反應，增強了細胞免疫、體液免疫和單核巨噬細胞功能，提示BSCP可作用于免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)，改善機體的免疫功能。按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)的1.2項，可判定寶樂果多糖具有增強免疫力的作用。因此，寶樂果多糖可以被視為潛在的免疫調節(jié)劑用于疾病的治療與食品的開發(fā)。

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［收稿2015-05-04修回2015-07-07］

(編輯許四平)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．010

通訊作者及指導教師:焦紅(1956年－)，女，研究員，碩士生導師，主要從事食品與化妝品功效研究與分析測試方面研究，E-mail: jhciq1228@ 163．com。劉博(1979年－)，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事藥物化學與新藥研發(fā)方面研究，E-mail: doctliu@ 263.net。

作者簡介:黎奔(1962年－)，女，主任藥師，碩士生導師，主要從事臨床藥學研究。

中圖分類號R285.5

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2015) 10-1342-05［摘要］目的:研究寶樂果多糖體內免疫活性。方法: 54只雄性BALB/c小鼠被隨機分為6組，每組9只。以80 mg/ (kg·d)腹腔注射環(huán)磷酰胺誘導的免疫功能低下小鼠為實驗對象，設100、200、400 mg/(kg·d)三個水平處理，飼養(yǎng)30 d后觀察多糖對細胞免疫功能、體液免疫功能和單核巨噬細胞功能的影響。結果:腹腔注射環(huán)磷酰胺可以顯著降低小鼠體內細胞免疫(P＜0.05 )，體液免疫(P＜0.01)和單核巨噬細胞(P＜0.01)的功能。寶樂果多糖能改善環(huán)磷酰胺誘導的免疫力低下，灌服低、中、高劑量的多糖能顯著改善小鼠體內細胞免疫功能(均為P＜0.05)和單核巨噬細胞的功能(均為P＜0.05)、而中、高劑量的多糖能顯著提高體液免疫功能(P＜0.01)。結論:寶樂果多糖能增強體內免疫力，并對環(huán)磷酰胺有一定的減毒作用。因此，寶樂果多糖可以作為一種免疫調節(jié)物質。［關鍵詞］寶樂果多糖;免疫活性;環(huán)磷酰胺誘導;體內