余毅愷　馮業(yè)晨　張木勛　葉　叢　涂　巍(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，武漢430030)

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可誘導(dǎo)共刺激分子配體上調(diào)Graves病動(dòng)物免疫應(yīng)答

余毅愷馮業(yè)晨張木勛葉叢涂巍
(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，武漢430030)

［摘要］目的:研究可誘導(dǎo)共刺激分子及配體(ICOS/ICOSL)在Graves病(以下簡(jiǎn)稱甲亢，GD)中的病理生理機(jī)制。方法: 45只遠(yuǎn)交系BALB/c小鼠隨機(jī)分成三組各15只，用基因槍將不同質(zhì)粒注射。A組采用表達(dá)pCDNA3.0-mICOSL和pCDNA3.0-hTSHR的質(zhì)粒免疫; B組用表達(dá)pCDNA3.0-hTSHR的質(zhì)粒免疫，C組采用空質(zhì)粒pcDNA3.0免疫作為對(duì)照組。放免法測(cè)定小鼠血清游離甲狀腺素(FT4)、脾臟細(xì)胞上清液IFN-γ度，ELISA法血清促甲狀腺素受體抗體(TRAb)，小鼠血清和轉(zhuǎn)染人hTSHR－CHO細(xì)胞共同孵育后檢測(cè)cAMP濃度判斷TRAb自身抗體活性。結(jié)果:質(zhì)粒注射后A組小鼠血清FT4水平(0.49± 0.25) pg/ml高于C組(q= 6.571，P=0.023) ;成模達(dá)標(biāo)率(10/15例)高于B、C兩組(χ2= 14.47，P= 0.005)。A組小鼠脾臟原代培養(yǎng)上清液IFN-γ的產(chǎn)量(1.88±0.41) pmol/L明顯高于B、C兩組(F= 17.85，P= 0.003)。A組小鼠血清TRAb活性188.3 (179.7～260.2) %高于B、C組(P= 0.027)。結(jié)論:外源性導(dǎo)入pCDNA3.0-mICOSL到GD小鼠，能刺激其脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，增加自身抗體TRAb活性，從而上調(diào)GD動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答。

［關(guān)鍵詞］ICOSL; Graves病; TSHR抗體;基因槍

①本文為2012年武漢科技局青年晨光計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.201 271031432)。

ICOSL could upregulate immune response in Graves's disease animal models

YU Yi-Kai，F(xiàn)ENG Ye-Chen，ZHANG Mu-Xun，YE Cong，TU Wei.Department of Rheumatology and Immunology Tongji Hospital，Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

［Abstract］Objective: To study the pathological mechanism of the inducible co-stimulator molecular and ligand (ICOS/ ICOSL) in Graves disease animal.Methods: 45 out-bred BALB/c mice were randomly divided into three groups with 15 rats in each group; using gene gun to deliver different plasmid injection.Group A was delivered with pCDNA3.0-mICOSL and pCDNA3.0-hTSHR，Group B with pCDNA3.0-hTSHR and null pCDNA3.0 with Group C for immunization as the control group.The concentration of serum free thyroxine immunization was deter mined with immunoassay and serum thyrotropin receptor antibody (TRAb) with ELISA，supernatant of IFN-γ concentration in mouse spleen cells was measured with radioimmunoassay，and hTSHR transected CHO cells were incubated to detect the concentration of cAMP to deter mine autoantibody TRAb activity.Results: After plasmid injection serum FT4 level in Group A (0.49±0.25) pg/ml (q= 6.571，P=0.023) was higher than that in Group C，the standard rate was higher than Group B and C (χ2= 14.47，P = 0.005) .IFN-γ concentration of mice spleen cultured supernatant in Group A (1.88±0.41) pmol/L was significantly higher than the other two groups.The activity of autoantibody TRAb in Group A 188.3 (179.7-260.2) % was higher than that in the other two groups(P=0.027) .Conclusion: Exogenous delivery of pCDNA3.0-mICOSL plasmid in GD mice could stimulate the spleen lymphocytes to secrete more IFN-γ，increase the activity of TRAb autoantibodies and might lead to upregulation of immune response in Graves animal model in vivo.

［Key words］ICOSL; Graves disease; TSHR autoantibody; Gene gun

GD是一種伴有甲狀腺激素增高的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制為甲狀腺細(xì)胞表面促甲狀腺素受體(TSHR)部分脫落被外周血APC(抗原呈遞細(xì)胞)攝取，降解為短肽和MHCⅡ分子結(jié)合于APC表面，形成第一信號(hào)(MHC-Ag肽信號(hào))由TCR識(shí)別。共刺激分子和APC表面受體結(jié)合，形成第二信號(hào)［1］。經(jīng)過(guò)上述“雙信號(hào)和雙識(shí)別”激活后，特異性T細(xì)胞活化并導(dǎo)致B細(xì)胞激活，產(chǎn)生促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)和TSHR結(jié)合，導(dǎo)致甲狀腺激素水平增高和相應(yīng)臨床癥狀。新近發(fā)現(xiàn)一種屬于B7分子超家族的可誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)，其配體(ICOSL)表達(dá)在APC表面呈可誘導(dǎo)性。ICOS僅在活化和記憶性T細(xì)胞上表達(dá)和自身免疫性疾病關(guān)系密切。Yoshinaga［2］報(bào)道ICOSL-Fc過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠可表現(xiàn)為人類Crohn病和高球蛋白血癥的臨床綜合征。Hamel等［3］發(fā)現(xiàn)在ICOSL(-/-)的BALB/c模型小鼠，使用免疫佐劑誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥明顯減輕。Her［4］報(bào)道在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周單核細(xì)胞ICOSL表達(dá)明顯增高且和狼瘡活動(dòng)SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)GD患者甲狀腺組織ICOSL表達(dá)也明顯增高［5，6］。

本研究分別用表達(dá)hTSHR和mICOSL的質(zhì)粒免疫小鼠，檢測(cè)自身抗體和脾臟細(xì)胞因子水平，試圖評(píng)價(jià)增加ICOSL表達(dá)對(duì)GD動(dòng)物免疫應(yīng)答過(guò)程的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組和造模4～6周遠(yuǎn)交系幼年雌性BALB/c鼠共45只購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［SCXK(鄂) 2004-0007］。按照體重依次給每個(gè)動(dòng)物編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字法分成3組每組15只: (1) ICOSL組(A組)同時(shí)注射pcDNA3.0-hTSHR和pcDNA3.0-mICOSL質(zhì)粒; (2) TSHR組(B 組)注射pcDNA3.0-hTSHR質(zhì)粒; (3) CLT組(C組)注射質(zhì)粒pcDNA3.0作為空白對(duì)照。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠頻繁取血后血清白蛋白可明顯下降導(dǎo)致甲狀腺素結(jié)合率降低影響血清FT4檢測(cè)，故CTL組15只小鼠基線期即采血測(cè)定血清FT4。

1.2方法

1.2.1大量擴(kuò)增制備質(zhì)粒并制造基因槍子彈上述質(zhì)粒大量擴(kuò)增后，運(yùn)用Tiangene公司質(zhì)粒大提試劑盒提取并純化。XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后測(cè)定純度和濃度。其中金顆粒和Helios基因槍購(gòu)自Biorad公司Biolistic PDS-1000/He，驅(qū)動(dòng)類型高壓氦氣。包被DNA微粒制作具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)。后腹部皮膚備皮后注射，劑量為10 μg質(zhì)粒DNA/次/小鼠/子彈，基因槍壓力為400 psi。

1.2.2測(cè)定小鼠血清FT4免疫動(dòng)物后第2周肝素抗凝處理的毛細(xì)玻管于小鼠內(nèi)眥靜脈取全血。放射免疫法測(cè)定FT4，于核醫(yī)學(xué)科采用DFM-96型10管放射免疫γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定。血清室溫放置后離心(15 min 3 500 r/min)，棄上清液測(cè)定各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)cpm。以S0(cpm數(shù))為B0，各標(biāo)準(zhǔn)管(cpm數(shù))為Bi，求各管的百分結(jié)合率(Bi/B0)。計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的結(jié)果在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以Bi/B0為縱坐標(biāo)，繪制Bi/B0－Log圖，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品濃度，超過(guò)C組小鼠FT4均數(shù)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差確認(rèn)為甲亢造模成功［7］。

1.2.3測(cè)定小鼠脾臟勻漿液IFN-γ質(zhì)粒免疫2周后將小鼠脾臟組織剪成1 mm3左右小塊。分離后的脾臟原代細(xì)胞放置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為RPMI1640培養(yǎng)基+10%熱滅活胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸鈉，50 μg/ml慶大霉素，50 μmmol/L β-硫氫基乙醇和100 U/ml青霉素。給予5 μg/ml刀豆素A(ConA IV Sigma公司，批號(hào)C2010，作為有絲分裂原可以刺激T淋巴細(xì)胞的增殖)和TSHR抗原(0.2 mU/ml)共同培養(yǎng)72 h后取培養(yǎng)上清液，5 000 r/min的速度下離心去除細(xì)胞沉渣。放射免疫法測(cè)定IFN-γ濃度。

1.2.4測(cè)定小鼠血清TRAb抗體滴度ELISA試劑盒購(gòu)自德國(guó)EuroImmune公司(批號(hào)03051986 190)由我院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室專職人員完成。試驗(yàn)步驟概括如下，以濃度為0～40 U/I的標(biāo)準(zhǔn)血清IgG為定標(biāo)品，酶標(biāo)儀于450nm測(cè)定樣品吸光值，樣本血清待測(cè)品TRAb濃度A(%) = (1－樣品吸光值/陰性對(duì)照吸光值)×100，其中每個(gè)定標(biāo)品樣本均設(shè)復(fù)孔。A＞25%判斷抗體為陽(yáng)性。

1.2.5測(cè)定小鼠血清TRAb抗體活性將轉(zhuǎn)染hTSH的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱hTSH-CHO)和小鼠血清共同培養(yǎng)72 h候收集上清，放免法測(cè)定cAMP濃度。試劑盒購(gòu)至北京東亞醫(yī)學(xué)研究所，于核醫(yī)學(xué)科采用DFM-96型10管放射免疫γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定。測(cè)定hTSHR-CHO細(xì)胞分泌上清液中cAMP濃度較正常對(duì)照血清的增幅來(lái)判斷抗體的活性。計(jì)算公式= (實(shí)驗(yàn)cAMP濃度－對(duì)照cAMP濃度) /對(duì)照cAMP濃度×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量數(shù)據(jù)資料經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間有無(wú)顯著性差異，隨后兩兩樣本均數(shù)間的比較采用Newman-Kelus分析。Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)比較非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組有無(wú)間顯著性差異，隨后兩兩比較采用Dunn's多重檢驗(yàn)。TRAb陽(yáng)性率比較采用行×列表的卡方檢驗(yàn)，如有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義再行分割進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05定義為統(tǒng)計(jì)顯著性水準(zhǔn)。所有統(tǒng)計(jì)分析采用SAS8.0軟件。

2　結(jié)果

2.1小鼠血清FT4水平質(zhì)粒注射后三組小鼠血清FT4濃度有差異(F=12.03，P=0.011)，Newman-Keuls多重檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，ICOSL組(0.49±0.25) pg/ml和TSHR組(0.43±0.17) pg/ml明顯高于CTL組(0.18±0.08) pg/ml(q= 6.571，P= 0.023; q= 5.211，P=0.034)。但是ICOSL和TSHR兩組無(wú)顯著性差異(q = 1.359，P = 0.460)。根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］GD動(dòng)物造模成功標(biāo)準(zhǔn)為血清FT4濃度超過(guò)0.42 pg/ml (即CTL值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差=0.18+0.08 ×3)，ICOSL組和TSHR組達(dá)標(biāo)分別10例和6例而CTL組為0。行×列表χ2檢驗(yàn)顯示ICOSL組高于其他兩組(χ2=14.47，P=0.005)，見(jiàn)圖1。

2.2小鼠脾臟IFN-γ產(chǎn)量ANONA顯示小鼠免疫2周后，脾臟細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液IFN-γ濃度(F = 17.85，P=0.003)。D'Agostino＆Pearson正態(tài)分布檢驗(yàn)，IFN-γ呈正態(tài)分布ANOVA進(jìn)行均數(shù)的組間比較。Newman-Kelus兩兩比較顯示，ICOSL組濃度為(1.88 ±0.41) pmol/L明顯高于TSHR組(1.54±0.28) pmol/ L(q=3.972，P=0.041)和CTL組(1.13±0.31) pmol/L (q=8.446，P=0.012)。見(jiàn)圖2。

淚水盈滿了我的雙眸，這世界上最痛苦的事，莫過(guò)于知道了結(jié)局，卻無(wú)法改變。我只有眺望遠(yuǎn)方，看看這江南最后的繁華。

圖1　三組小鼠血清FT4水平比較Fig．1 Comparison of serum FT4 among three groups

圖2　質(zhì)粒免疫后脾臟組織勻漿IFN-γ濃度Fig．2 IFN-γ concentration of spleen homogenate after plasmid immunization

2.3小鼠自身抗體TRAb陽(yáng)性率和活性比較ELISA法檢測(cè)ICOSL和TSHR兩組TRAb陽(yáng)性例數(shù)分別為11和4，CTL組為0。Fiseher精確概率法顯示ICOSL組陽(yáng)性率高于TSHR組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.394，P=0.065)。

質(zhì)粒免疫2周后取小鼠血清和hTSHR-CHO細(xì)胞培養(yǎng)后測(cè)定分泌上清液中cAMP濃度計(jì)算TRAb活性。Dunn's多重檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較ICOSL組TRAb活性188.3(179.7，260.2) %明顯高于TSHR 組162.2(60.7，170.5) %和CTL組88.6［(66.1，87.9) %，P=0.027］，見(jiàn)圖3。

Note: The horizontal ordinate represents different groups and the longitudinal ordinate represents relative activity of serum auto-antibody TRAb.* .P＜0.05.

3　討論

Wang等［5］利用11C4、12B11和MIH12三種針對(duì)不同表位的ICOSL單抗進(jìn)行組織學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在甲功正常和腺瘤患者甲狀腺組織ICOSL表達(dá)極低，而在GD患者ICOSL表達(dá)明顯增高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ICOS/ICOSL系統(tǒng)過(guò)度活化可以導(dǎo)致免疫應(yīng)答和自身抗體產(chǎn)生異常增強(qiáng)。抑制T細(xì)胞和APC之間的共刺激分子信號(hào)通路，能抑制GD小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答過(guò)程［8］。

本課題組在隨訪96例GD患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，共刺激分子CD80 mRNA高表達(dá)和TRAb抗體持續(xù)陽(yáng)性，都是GD預(yù)后不良危險(xiǎn)因素(P = 0.034，OR = 3.089)。Logistic回歸分析顯示:影響GD預(yù)后的諸多危險(xiǎn)因素中，CD80高表達(dá)僅次于TRAb，相關(guān)性高達(dá)0.79。

基因槍將外源基因，擊中并高速穿透真空室中受體細(xì)胞膜，將吸附于微彈上的外源DNA導(dǎo)細(xì)胞導(dǎo)入機(jī)體，被惰性金屬金顆粒包裹，緩慢釋放獲得整合與表達(dá)。在GD動(dòng)物模型制備中，質(zhì)粒DNA非外源蛋白質(zhì)或減毒活疫苗注入，極少引起超敏反應(yīng)(無(wú)一例動(dòng)物注射質(zhì)粒后死亡)，可被皮下APC細(xì)胞攝取［9，10］。ICOSL表達(dá)質(zhì)粒的加入能增加抗原呈遞中“MHC-多肽雙信號(hào)-雙識(shí)別”的作用。

伍麗萍報(bào)道造模后GD小鼠50% TRAb水平增高，21.4%血清TT4增高且TT4增高的小鼠有不同程度的體重降低。我們已成功利用TSHR質(zhì)粒誘導(dǎo)GD動(dòng)物模型［11］，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)增加GD小鼠ICOSL表達(dá)，2周后血清FT4為(0.49±0.25) pg/ml高于CTL組(0.18±0.08) pg/ml。雖然較TSHR組(0.43±0.17) pg/ml無(wú)顯著性差異，但I(xiàn)COSL組血清FT4水平超過(guò)CTL組3倍標(biāo)準(zhǔn)差例數(shù)為10例，明顯高于TSHR組6例。

IFN-γ是一種促炎因子在自身免疫性疾病中起重要作用。Minelli［10］報(bào)道慢性丙型病毒性肝炎患者運(yùn)用人重組干擾素治療時(shí)，包括甲亢等多種自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)病率增高。ICOSL組小鼠脾臟細(xì)胞受到TSHR抗原刺激，上清液分泌INF-γ(1.88± 0.41) pmol/L明顯高于TSHR組(1.54±0.28) pmol/ L和CTL組(1.13±0.31) pmol/L，說(shuō)明在增加GD小鼠ICOSL表達(dá)后，能增強(qiáng)體內(nèi)免疫應(yīng)答過(guò)程。

未經(jīng)治療的GD患者TRAb陽(yáng)性可高達(dá)91.7%，是臨床評(píng)價(jià)疾病預(yù)后指標(biāo)之［12］。雖然ICOSL和TSHR組的小鼠TRAb陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異，但I(xiàn)COSL組TRAb抗體活性188.3 (179.7，260.2) %明顯高于CTL組88.6(66.1，87.9) %和TSHR組162.2(60.7，170.5) %。

質(zhì)粒導(dǎo)入增加外源性ICOSL表達(dá)，增強(qiáng)GD小鼠免疫應(yīng)答，表現(xiàn)TRAb自身抗體活性增高和脾臟分泌IFN-γ增多。若能阻斷ICOS/ICOSL交聯(lián)產(chǎn)生的共刺激信號(hào)，能否為治療自身免疫性疾病特別是GD提供新的藥物靶點(diǎn)，值得深入研究。本研究不足之處在于，未進(jìn)一步觀察Anti-ICOSL抗體注射后小鼠免疫應(yīng)答下調(diào)的影響。由于Anti-ICOSL抗體價(jià)格昂貴，僅在預(yù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了Anti-ICOSL(Protein Group Inc，Cat: 14922-1-AP，24 μg/150 ml)部分小鼠出現(xiàn)超敏反應(yīng)導(dǎo)致死亡，故抗體種類和注射時(shí)機(jī)的選擇還需要進(jìn)一步摸索。

致謝:質(zhì)粒pCDNA3.0-mICOSL和pCDNA3.0-hTSHR日本長(zhǎng)歧大學(xué)Nagayama教授提供。

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［收稿2015-04-20修回2015-06-01］

(編輯許四平)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．005

作者簡(jiǎn)介:余毅愷(1980年－)，男，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事自身免疫性疾病的研究。

文章編號(hào)1000-484X(2015) 10-1320-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號(hào)R392