強葉濤　吳水蕓韓慕天　程　璐　金慧敏嚴　成李　翀劉　霞　張苗苗　邵啟祥　夏　圣(江蘇大學醫(yī)學院免疫學與免疫檢驗學系，鎮(zhèn)江212013)

?

丁酸對小鼠骨髓源樹突狀細胞的免疫調節(jié)作用①

強葉濤吳水蕓②韓慕天程璐金慧敏②嚴成②李翀③劉霞張苗苗邵啟祥夏圣(江蘇大學醫(yī)學院免疫學與免疫檢驗學系，鎮(zhèn)江212013)

［摘要］目的:觀察腸道細菌代謝產物丁酸對體外培養(yǎng)小鼠骨髓源樹突狀細胞(Bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)表型及功能的影響，并探討其可能的機制。方法:利用丁酸鹽對GM-CSF和IL-4體外誘導的BMDCs細胞進行處理，采用流式細胞術檢測BMDCs細胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC的表達及其對T細胞增殖的影響;用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測其細胞因子IL-6、IL-12的表達;用格里斯反應(Griess reaction)和免疫印跡法(Western blot)分別檢測DC細胞產生NO(2－)的生成和Toll樣受體-4(TLR4)信號通路中ERK分子的磷酸化。結果:丁酸可下調LPS誘導的成熟BMDCs細胞CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC分子的表達。同時，丁酸也可抑制IL-6和IL-12的分泌，并抑制樹突狀細胞對OVA257-264抗原特異性T細胞的增殖。進一步的Western blot檢測結果顯示丁酸可抑制DC細胞TLR4信號通路中ERK分子的磷酸化。結論:丁酸可通過抑制DC細胞TLR4信號通路中ERK分子的磷酸化，下調DC細胞的免疫功能。

［關鍵詞］丁酸鹽;樹突狀細胞;共刺激分子;細胞因子; CD8+T細胞; TLR4

①本文受國家自然科學基金(81172834，31428006，31570879)和江蘇大學醫(yī)學臨床科技發(fā)展基金(JLY20140048)資助。

②江蘇大學醫(yī)學院檢驗醫(yī)學研究所，鎮(zhèn)江212013。

③江蘇大學附屬昆山醫(yī)院，昆山215300。

Immunomodulatory effects of butyrate on bone marrow derived dendritic cells

QIANG Ye-Tao，WU Shui-Yun，HAN Mu-Tian，CHENG Lu，JIN Hui-Min，YAN Cheng，LI Chong，LIU Xia，ZHANG Miao-Miao，SHAO Qi-Xiang，XIA Sheng.Department of Immunology，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China

［Abstract］Objective: To investigate the effect of butyrate produced by bacterial metabolism on immune features of murine bone marrow-derived dendritic cells(BMDCs) and its potential mechanisms.Methods: BMDCs were prepared from bone marrow cells of C57BL/6 mice by being cultured with GM-CSF and IL-4.The expression of CD80，CD86，B7-DC and MHCⅡon BMDCs and its priming ability on the proliferation of OVA257-264 antigen specific CD8+T cell were analyzed by using Flow cytometry.The mRNA levels of IL-6 and IL-12 in BMDCs were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(q-PCR)．Simultaneously，Griess reaction and Western blot was used for analyzing the levels of NO2－in BMDCs culture supernatant and the ERK phosphortylation in BMDCs respectivly.Results: Butyrate could decrease the levels of CD80，CD86，MHCⅡand B7-DC，and downregulate the capability of BMDCs in priming the proliferation of CD8+T cells.Furthermore，the secretions of IL-6，IL-12，NO2－and the phosphorylation of ERK were suppressed.Conclusion: Butyrate down-regulats the immune functions of BMDCs via inhibition of ERK phosphorylation in TLR4 signaling pathway.

［Key words］Butyrate; Dendritic cell; Costimulatory molecule; Cytokine; CD8+T; TLR4

人及動物腸道內的短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFAs)是腸道內正常微生物群的代謝產物，是維持腸道正常生理功能和腸道免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素。丁酸鹽作為腸道內最豐富的、具有生物活性的短鏈脂肪酸，不但是小腸上皮細胞的營養(yǎng)因子，維持上皮細胞的生長［1，2］，而且還能夠阻止結腸癌細胞的細胞周期循環(huán)和誘導結腸癌細胞凋亡［3］。同時，作為一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor，HDACi)，丁酸鹽也具有潛在的免疫調節(jié)作用［4］。在細胞內，組蛋白乙?；芙M蛋白乙酰轉移酶(Histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)調節(jié)。組蛋白乙?；軌蛞鸺毎巳旧|擴張，并且增強調控蛋白與DNA的親和力，而組蛋白去乙?；瘎t會引起核染色質縮合和轉錄阻遏［5］。HDACi對腫瘤細胞的效應已有明確報道。HDACi可通過改變基因的轉錄阻止腫瘤細胞的生長、分化，從而誘導細胞凋亡［6］。近期的研究報道也表明，HDACi有抗血管增生和免疫調節(jié)的作用，可使一些免疫性疾病和炎性疾病的體征得到改善，如可很大程度緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的蛋白尿、腎小球腎炎等［7］。樹突狀細胞(DCs)是體內重要的抗原提呈細胞，在免疫系統(tǒng)中起重要的作用。鑒于DCs細胞表型與功能的可塑性，我們推測有去乙?；敢种苿┬拇x產物丁酸等短鏈脂肪酸可能具有調節(jié)DCs細胞特性的功能，并參與體內免疫穩(wěn)態(tài)的維持。因此，本研究中以體外培養(yǎng)的骨髓源DCs細胞作為研究對象，探討了丁酸對DCs細胞的免疫調節(jié)功能，并對其可能機制做了初步的探討。

1　材料與方法

1.1實驗動物6～12周齡的雌性C57/BL6小鼠(購自揚州大學比較醫(yī)學中心)，6～12周齡的H2kb-OVA257-264肽抗原特異性的OT1小鼠購自Jackson Lab后，本室繁育后用于實驗。

1.2主要試劑和儀器丁酸鈉鹽(Sigma公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(PAA公司)，6孔板、24孔板、96孔板(Nunc公司)，脂多糖(LPS，Sigma公司)，卵清蛋白(OVA，Sigma公司)，總RNA提取試劑Trizol(TaKaRa公司)，逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)，SYBR Green熒光染料(TaKaRa公司)，CFSE熒光染料(Invitrogen公司)，RIPA裂解液(TaKaRa公司)，CD11b-FITC、CD11c-Biotin-cy5.5、CD80-PE、CD86-PE、MHC-Ⅱ-FITC、B7-DC-FITC、TLR4-Biotincy5.5、CD8－Biotin-cy5.5、CD8－PE (eBioscience公司)，磁分選試劑盒(Stem cell公司)，7-AAD(eBioscience公司)，p-erk和t-erk抗體(eBioscience公司)，超凈工作臺(蘇州凈化廠)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma公司)，倒置式生物顯微鏡(Nikon公司)，PCR儀(Bio-Rad公司)，臺式離心機(Thermo公司)，CFX96定量PCR儀(Bio-Rad公司)，FACS Calibur流式細胞儀或BD Accuri C6流式細胞儀(BD公司)。

1.3小鼠骨髓源樹突狀細胞(BMDCs)的體外培養(yǎng)

參照文獻［8］進行。簡述之，將C57/BL6小鼠處死后，取股骨與脛骨。用無菌PBS液沖洗骨髓腔，制備骨髓細胞。將骨髓細胞用含10%FCS、GM-CSF (10 ng/ml)、IL-4(1 ng/ml)的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條例下進行培養(yǎng)7 d后，收獲并純化CD11c+細胞，作為不成熟BMDC細胞。將加入LPS(終濃度為1 μg/ml)的細胞作為成熟BMDC細胞。

1.4丁酸對BMDCs膜表面共刺激分子和MHCⅡ的影響將誘導培養(yǎng)7 d的BMDC細胞，按每孔5× 105細胞加入到24孔板中，分別加入LPS或丁酸鹽(終濃度0.5 mmol/L)后繼續(xù)培養(yǎng)18 h。收集細胞，用大鼠血清封閉10 min后，4℃條件下，將細胞液中分別加入熒光素標記的CD80、CD86、MHCⅡ和B7-DC等抗體，標記15 min。將標記完成的細胞用PBS液洗二遍后，用流式細胞分析儀檢測標記細胞的熒光信號，并用Flowjo軟件分析。

1.5丁酸對BMDCs分泌IL-6、IL-12和NO的影響

細胞的處理與準備同1.4。細胞處理完成后，加入TRIZOL裂解BMDC細胞，提取其總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書將2 μg RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內參，定量檢測擴增IL-6、IL-12基因的表達。所用引物序列如下: GAPDH上游序列GGCATTGCTCTCAATGACAA，下游序列TGTGAGGGAGATGCTCAGTG; IL-6上游序列GAGGAGACTTCACAGAGGATAC，下游序列GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTG; IL-12上游序列GGTTTGCCATCGTTTTG，下游序列GGGTCTTTCCAGAGCCT。Real-time PCR反應體系: SYBRGreen 5 μl、上下游引物各0.2 μl、cDNA模板0.5 μl、ddH2O 4.1 μl，總反應體系為10 μl。擴增條件: 95℃5 s，58℃20 s，72℃31 s，39個循環(huán)。采用2－△△CT法計算相對基因表達。另外，收集18h后的各組上清，按照Griess reaction試劑盒說明采用酶標儀檢測上清中NO2－的含量。

1.6丁酸對BMDCs激活抗原特異性CD8+T細胞增殖能力的評估細胞的處理與準備同1.4。將BMDCs用OVA抗原處理6 h。另分離H2kb-OVA257-264肽抗原特異性OT1小鼠的脾臟，碾磨、破紅細胞后用PBS洗一次。去上清，留余液混勻，將細胞轉移到分選管，加CD8－Biotin-cy5.5抗體，室溫15 min;加試劑盒中Biotin Selection Cocktail，室溫15 min;補加DMEM培養(yǎng)基到分選管，混勻，將分選管插入分選磁鐵中，5 min，棄去液體;加PBS混勻細胞，再重復分選二次。加PBS吹打混勻細胞，并轉移至離心管，重懸細胞;加CFSE于37℃、10 min進行細胞標記。將經OVA處理后的各組DC與經過CFSE標記的CD8+T細胞共培養(yǎng)，兩者細胞比為2× 104∶2×105，37℃、5%CO2條例下培養(yǎng)4 d后，將細胞標記熒光抗體anti-CD8、7-AAD，流式細胞儀檢測CD8+T細胞增殖情況。

1.7丁酸對LPS刺激的TLR4信號通路ERK分子磷酸化的影響將誘導培養(yǎng)7 d后的BMDC，按每孔5×105細胞加入到24孔板中，分別在0、15、30、60 min時分別加入LPS或丁酸鹽(終濃度0.5 mmol/L)處理細胞，之后再加入RIPA裂解液提取蛋白，Western blot檢測各組中TLR4信號通路ERK分子的磷酸化。

1.8統(tǒng)計學分析實驗數據用GraphPad Prism 5.0軟件分析處理。兩組間比較采用t檢驗;多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1丁酸對BMDCs細胞膜表面分子的影響從圖1可看出，相對于不成熟BMDCs，LPS刺激成熟的BMDCs細胞的膜表面分子CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC熒光信號強度出現右移，表達上調;但丁酸處理后可使這些膜表面分子的熒光信號強度又出現左移，表達下調。此結果說明丁酸能夠抑制BMDCs細胞的成熟。但是，不成熟BMDCs組與丁酸鹽/不成熟DC組間的結果顯示，丁酸處理后不成熟BMDCs細胞表面的CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC表達沒有明顯改變。此結果提示丁酸對于成熟BMDCs細胞的表型有明顯的抑制效應，而對于不成熟的BMDCs細胞并無明顯影響。

2.2丁酸對BMDC細胞IL-6、IL-12和NO分泌的影響不成熟BMDCs組與LPS刺激成熟BMDCs組比較顯示，成熟BMDCs分泌的細胞因子IL-6、IL-12(圖2A)和NO(圖2B)明顯增加。但加入丁酸鹽處理后，該BMDCs細胞對此類細胞因子和NO的分泌水平出現明顯下降。此結果說明成熟BMDCs分泌的IL-6、IL-12、NO受到丁酸的抑制。但不成熟BMDCs組與丁酸鹽/不成熟BMDCs組間結果比較顯示，BMDCs分泌的IL-6、IL-12、NO并未受到影響，以上結果說明丁酸的處理能夠抑制成熟BMDCs細胞分泌細胞因子IL-6、IL-12、NO，而對不成熟BMDCs細胞并無影響。

圖1　丁酸對BMDC細胞膜表面分子的影響Fig．1 Effects of butyrate on phenotype of BMDCs

Note: * .P＜0.01 vs BMDC;＊＊.P＜0.001 vs BMDC; ns.No significance.1.BMCD; 2.BMDC+LPS; 3.BMDC+LPS+Bu; 4.BMDC +Bu.

2.3丁酸對BMDCs激活抗原特異性CD8+T細胞增殖能力的影響B(tài)MDCs細胞主要的功能之一是激活抗原特異性T細胞的活化與增殖。為進一步研究丁酸對BMDCs細胞功能的影響，我們將OVA抗原特異性OT1 CD8+T細胞進行CFSE標記后，與OVA荷載的BMDCs進行共培養(yǎng)，然后分析7-AAD-CD8+T細胞的CFSE熒光強度來反映CD8+T細胞增殖情況。圖3和表3中的結果顯示，體外培養(yǎng)的不成熟BMDCs細胞與LPS刺激成熟BMDCs細胞均可引起OVA抗原特異性CD8+T的增殖，但成熟BMDCs顯示出較不成熟BMDCs細胞更強的激活CD8+T細胞增殖的能力，該組的CD8+T細胞增殖分裂甚至可達到第7代，其第6代的CFSE熒光信號強度也強于不成熟BMDCs細胞組。但加入丁酸處理后，成熟BMDCs激活的CD8+T細胞增殖、分裂出現明顯抑制。BMDC/LPS/ BU組的CFSE熒光強度較BMDC/LPS組出現明顯右移。此結果說明丁酸的加入使OVA抗原特異性CD8+T細胞的增殖受到明顯抑制。而不成熟BMDCs細胞組與丁酸/不成熟BMDCs細胞組的結果顯示，兩組間T細胞的增殖的CFSE熒光信號強度最強的都在第4代，表示主峰都在第4代;同時，兩組的最高細胞分裂代數可達6代，提示丁酸對不成熟BMDCs細胞組無明顯抑制功能。

2.4丁酸對BMDC細胞TLR4信號通路ERK分子磷酸化的影響利用Western blot檢測0、15、30、60 min時不同組BMDCs細胞MAPK通路信號分子ERK磷酸化的表達，并結合灰度掃描分析的結果顯示:與不成熟BMDCs組相比，受LPS刺激成熟的BMDCs細胞胞內ERK分子的磷酸化在15、30、60 min時間點上均發(fā)生上調;而丁酸處理后，其三個時間點的磷酸化ERK的表達均有下降，且以60 min時下降最為明顯，說明丁酸的處理對LPS激活的成熟BMDCs細胞MAPK信號通路ERK分子磷酸化有抑制作用。

表1　 OVA抗原特異性CD8+T細胞不同分裂代中細胞比例分析Tab．1 Percentage of divided OVA specific CD8+T cells in different groups

圖3　丁酸對OVA抗原荷載BMDCs激活抗原特異性CD8+T細胞增殖能力的影響Fig．3 Effects of butyrate on capability of BMDCs in priming OVA specific CD8+T cell proliferation

3　討論

眾所周知，人體腸道微生物菌群及其代謝產物在維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。作為腸道微生物的代謝產物之一，丁酸在腸道內呈現出較高的豐度，有文獻報道，其小腸中的濃度達到0.1 mmol/L到16 mmol/L，而結腸中的濃度甚至可達到40 mmol/L［9］。如此高濃度的丁酸提示著該分子可能是腸道菌群調控機體免疫功能的重要分子之一。有報道認為，丁酸可促進胸腺外調節(jié)性T細胞(Tregs)的分化與產生。該短鏈脂肪酸可依賴于固有Foxp3的增強子即保守非編碼序列1(CNS1)促進胸腺外，而非胸腺內調節(jié)性T細胞(Tregs)的分化，并且可與T細胞相互作用增強Foxp3蛋白的乙?；?。也有研究認為，作為組蛋白去乙酰化抑制劑的丁酸在與DCs的相互作用中能降低促炎細胞因子的表達，從而加強Tregs的誘導［10］。丁酸也可通過對組蛋白去乙?；囊种葡抡{脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞分泌的促炎性介質，調節(jié)巨噬細胞的功能［11］。本研究結果顯示，丁酸能夠在體外抑制成熟BMDC細胞共刺激分子的表達，下調其IL-12等細胞因子的表達，并抑制BMDCs細胞的抗原提呈功能。

圖4　丁酸對BMDCs細胞TLR4信號通路中ERK磷酸化的影響Fig．4 Effects of butyrate on ERK phosphorylation in BMDCs

樹突狀細胞(DCs)是機體特異性免疫應答的始動者，能誘導初始T細胞活化，同時也是體內重要的免疫調節(jié)細胞，可通過分泌不同的細胞因子參與固有和適應性免疫應答。來自微生物的病原相關分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMPs)分子，如LPS等，能使未成熟的DCs細胞獲得成熟的表型，上調MHC分子和共刺激分子的表達，使DCs細胞獲得誘導初始T細胞活化的能力［12］。在正常的機體內，腸道內有著大量正常菌群的定居，其固有的PAMPs分子有著潛在的活化體內DC細胞功能的強大效應。這對于機體的免疫系統(tǒng)是十分危險的，因此，需要有一定的負相調節(jié)機制對其進行制約，以維持機體內的免疫穩(wěn)態(tài)。而對腸道區(qū)域內DC細胞群體及功能的分析也發(fā)現，該區(qū)域內定居的DC細胞對外來的抗原刺激呈現低反應［13，14］。考慮到丁酸在腸道內的高豐度存在，并結合其對其他免疫細胞已有的調節(jié)作用［10，11］，我們推測其對DC細胞有負相調控效應，以降低DC的反應性，參與機體的免疫穩(wěn)態(tài)。確實，丁酸對于LPS刺激成熟的BMDC細胞的表型及功能有著明顯的抑制效應，顯示了其對DC細胞的免疫負向調節(jié)功能，及其在維持免疫穩(wěn)態(tài)中的潛在重要作用。但有意思的是，該短鏈脂肪酸分子對于未成熟的BMDC細胞的調控作用不明顯，提示其可能通過干擾LPS介導的模式識別分子信號通路來下調DC細胞的功能。

已有的研究認為，LPS通過TLR4活化DC細胞至少通過兩條分子信號通路［15］。其中之一是NF-κB激活途徑，即LPS與一系列相關分子作用激活有絲分裂原結合蛋白激酶(MAPK)途徑，MAPK被活化后可磷酸化ERK、JNK、P38等多種底物，調節(jié)相關基因的轉錄［16］。因此本實驗選取MAPK途徑中的ERK分子做檢測，結果表明丁酸處理之后LPS刺激在BMDCs細胞中誘導的ERK分子的磷酸化確實受到抑制，提示其可能通過干擾MAPK通路，從而抑制LPS引起的樹突狀細胞的成熟與功能。但鑒于TLR4信號分子通路的復雜性，在此效應中是否還有MAPK途徑中的其他信號分子或其他通路分子參與;同時，丁酸對其他PAMPs分子介導的信號通路是否也有類似的效應，如TLR2通路，還需要進一步研究。

參考文獻:

［1］Koruda MJ，Rolandelli RH，Bliss DZ，et al．Parenteral nutrition supplemented with short-chain fatty acids: effect on the small-bowel mucosa in normal rats［J］．Am J Clin Nutr，1990，51(4) : 685-689.

［2］Agarwal VP，Schimmel EM.Diversion colitis: a nutritional deficiency syndrome?［J］．Nutr Rev，1989，47(9) : 257-261.

［3］Freeman HJ.Effects of differing concentrations of sodium butyrate on 1，2-dimethylhydrazine-induced rat intestinal neoplasia［J］．Gastroenterology，1986，91(3) : 596-602.

［4］Berndt BE，Zhang M，Owyang SY，et al．Butyrate increases IL-23 production by stimulated dendritic cells［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303(12) : G1384-G1392.

［5］Jenuwein T，Allis CD.Translating the histone code［J］．Science，2001，293(5532) : 1074-1080.

［6］Marks P，Rifkind RA，Richon VM，et al．Histone deacetylases and cancer: causes and therapies［J］．Nat Rev Cancer，2001，1(3) : 194-202.

［7］Mishra N，Reilly CM，Brown DR，et al．Histone deacetylase inhibitors modulate renal disease in the MRL-lpr/lpr mouse［J］．J Clin Invest，2003，111(4) : 539-552.

［8］Xia S，Guo Z，Xu X，et al．Hepatic microenvironment programs hematopoietic progenitor differentiation into regulatory dendritic cells，maintaining liver tolerance［J］．Blood，2008，112 (8) : 3175-3185.

［9］Cummings JH，Pomare EW，Branch WJ，et al．Short chain fatty acids in human large intestine，portal，hepatic and venous blood ［J］．Gut，1987，28(10) : 1221-1227.

［10］Arpaia N，Campbell C，Fan X，et al．Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation ［J］．Nature，2013，504(7480) : 451-455.

［11］Chang PV，Hao L，Offermanns S，et al．The microbial metabolite butyrate regulates intestinal macrophage function via histone deacetylase inhibition［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2014，111 (6) : 2247-2252.

［13］Chang SY，Ko HJ，Kweon MN，et al．Mucosal dendritic cells shape mucosal immunity［J］．Exp Mol Med，2014，46: e84.

［14］Han D，Walsh MC，Cejas PJ，et al．Dendritic cell expression of the signaling molecule TRAF6 is critical for gut microbiota-dependent immune tolerance［J］．Immunity，2013，38(6) : 1211-1222.

［15］Lu YC，Yeh WC，Ohashi PS.LPS/TLR4 signal transduction pathway［J］．Cytokine，2008，42(2) : 145-151.

［16］Cao W，Bao C，Padalko E，et al．Acetylation of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 inhibits Toll-like receptor signaling ［J］．J Exp Med，2008，205(6) : 1491-1503.

［收稿2015-04-04修回2015-04-28］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．004

通訊作者及指導教師:夏圣(1971年－)，男，博士，教授，主要從事代謝免疫與免疫調節(jié)方面的研究，E-mail: xiasheng1519@ 163．com。

作者簡介:強葉濤(1991年－)，女，主要從事代謝與免疫方面的研究。

文章編號1000-484X(2015) 10-1315-05

文獻標志碼A

中圖分類號R392.12