王亞群　韓秋菊　龐　敏　張　建(山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥理與免疫治療學(xué)研究所，濟(jì)南250012)

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靶向阻斷STAT3增強(qiáng)肝癌細(xì)胞H22對(duì)化療藥物阿霉素的敏感性①

王亞群韓秋菊龐敏張建
(山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥理與免疫治療學(xué)研究所，濟(jì)南250012)

［摘要］目的:探討STAT3阻斷劑Decoy ODN與臨床常用肝癌化療藥阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)和順鉑(cisplatin)聯(lián)合使用對(duì)肝癌的治療效果及其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。方法:肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Decoy ODN后用化療藥處理，以MTT法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖能力，Annexin-V/7AAD雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;對(duì)H22荷瘤小鼠進(jìn)行Decoy ODN和阿霉素聯(lián)合治療，觀察小鼠腫瘤生長情況以及生存期;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)治療后小鼠PBMC的細(xì)胞分群和活化水平，以及阿霉素或阿霉素處理的腫瘤細(xì)胞對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外活化作用。結(jié)果:轉(zhuǎn)染Decoy ODN以后，阿霉素對(duì)H22細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)，H22細(xì)胞凋亡率也明顯升高。Decoy ODN和阿霉素聯(lián)合治療可明顯降低小鼠腫瘤生長速度并延長荷瘤小鼠的生存期;低劑量阿霉素增加了PBMC中T細(xì)胞的比例和CD69分子的表達(dá)，以及NK細(xì)胞CD107a和IFN-γ的表達(dá);阿霉素處理的H22細(xì)胞可促進(jìn)T細(xì)胞比例的升高。結(jié)論: Decoy ODN阻斷肝癌細(xì)胞STAT3后可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞H22對(duì)阿霉素的敏感性，提高化療效果，降低化療毒副作用，改善機(jī)體免疫功能。

［關(guān)鍵詞］STAT3; Decoy;阿霉素;肝癌

①本文為國家自然科學(xué)基金(81373222)資助項(xiàng)目。

Targeted blocking STAT3 enhances sensitivity of liver cancer cell H22 to chemotherapy drug doxorubicin

WANG Ya-Qun，HAN Qiu-Ju，PANG Min，ZHANG Jian.Institute of Immunopharmacology and Immunotherapy，School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China

［Abstract］Objective: To investigate the theraputic effect of STAT3 Decoy-ODN combined with chemotherapy drugs for HCC commonly used in clinical，include doxorubicin (DOX)，5-fluorouracil (5-Fu) and cisplatin; and，analyzing the impact of combination therapy on the immune system.Methods: MTT assay was used to detect cell proliferation，and Annexin-V /7AAD double staining assay was used to detect the apoptosis of Decoy ODN transfected-hepatoma cells treated with chemotherapy drugs.The tumor growth and survival rate of H22 tumor-bearing mice treated with DOX combined with STAT3 Decoy-ODN or not were observed.FACS was applied to analyze the subpopulation and activation of PBMCs from tumor-bearing mice treated as above，and to evaluate the influence of DOX or DOX-treated tumor cells on spleen lymphocyte activation.Results: DOX-induced the suppression and the apoptosis of H22 were significantly increased by Decoy ODN transfection.The combination treatment of Decoy ODN and DOX significantly reduced H22 tumor growth and extended the survival of tumor-bearing mice.Low-dose DOX could increase the proportion of T cells and CD69+T cells in PBMCs，as well as the expression of CD107a and IFN-γ in NK cells.DOX-treated H22 cells increased the proportion of T cells.Conclusion: Targeted blocking STAT3 could enhance the sensitivity of liver cancer cells to doxorubicin.So，combination therapy may improve DOX therapeutic effect and reduce DOX-mediated side effects.Furthermore，low dose of DOX can promote the activation of host immune system by acting on tumor cells.

［Key words］STAT3; Decoy; Doxorubicin; HCC

肝癌是世界上常見的癌癥之一，其發(fā)病率和死亡率均位居前列。由于飲食以及慢性肝炎等致癌風(fēng)險(xiǎn)因素，我國在肝癌的防治方面仍面臨著極大的挑戰(zhàn)。目前臨床上治療肝癌多采用傳統(tǒng)的手術(shù)治療以及輔助化療的方式。由于化療過程中肝癌細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性，并且化療藥物通常靶向性低，對(duì)正常細(xì)胞有著不可逆的損傷作用，從而導(dǎo)致相當(dāng)大的毒副作用。因此，發(fā)現(xiàn)新的化療藥物、調(diào)整治療策略(如聯(lián)合治療)是解決這一問題的關(guān)鍵。

信號(hào)轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞和基因調(diào)控因子，其調(diào)控的下游基因主要包括細(xì)胞周期控制基因Cyclin D1、抗凋亡基因Bclxl和Mcl-1，以及腫瘤惡性轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等［1-6］。許多研究證實(shí)，STAT3在多種癌癥細(xì)胞中持續(xù)過度表達(dá)［7］，如肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖;另外，STAT3的高度表達(dá)還會(huì)誘導(dǎo)腫瘤免疫耐受相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，如細(xì)胞因子TGF-β和IL-10，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答［8］。因此，靶向STAT3的抗腫瘤治療成為近年的研究熱點(diǎn)。

靶向STAT3誘騙寡核苷酸(Decoy ODN)是人工合成的與STAT3有高度親和力的雙鏈DNA，將其導(dǎo)入靶細(xì)胞中后，能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷STAT3與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而抑制STAT3下游基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移［2，9］。本研究利用Decoy ODN阻斷肝癌細(xì)胞STAT3信號(hào)通路，觀察其與臨床常用化療藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌的治療效果，為改善臨床化療策略提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系小鼠肝癌細(xì)胞系H22，來源于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，雄性，6～8周齡，購于北京華阜康生物科技有限公司。

1.1.3試劑阿霉素(Doxorubicin)購自北京華奉聯(lián)博科技有限公司; 5-氟尿嘧啶(5-Fu)和順鉑(cisplatin)購自北京百靈威科技有限公司;陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM-2000購自Invitrogen公司; MTT購自Sigma公司; DMSO購自上海生工生物工程有限公司; PMA和離子霉素購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; RPMI1640購于Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司; Annexin V-FITC/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物有限公司。流式抗體: FITC標(biāo)記的Anti-Murine CD49b(clone DX5)、Anti-Murine CD19，PE標(biāo)記的Anti-Murine CD107a、Anti-Murine IFN-γ、Percp-cy5.5標(biāo)記的Anti-Murine CD3e、APC標(biāo)記的Anti-Murine CD69和Anti-Murine TNF-α，均購自Ebioscience公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 STAT3 decoy ODN參照Leong等［10］報(bào)道的方法設(shè)計(jì)，兩條互補(bǔ)序列分別為5'-CATTTCCCGTAAATC-3'和5'-GATTTACGGGAAATG-3'，所有堿基硫代修飾，由大連寶生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染H22細(xì)胞復(fù)蘇后腹腔注射于昆明小鼠，一周后抽取小鼠腹水，PBS洗兩遍后，以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2的條件下。將細(xì)胞接種于六孔板中，于無血清培養(yǎng)基的條件下進(jìn)行Decoy-ODN (100 nmol/L)轉(zhuǎn)染8 h，然后補(bǔ)充胎牛血清至10%終止轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖收集轉(zhuǎn)染Decoy-ODN的細(xì)胞接種于96孔板，分別加入阿霉素(10 μg/ml，5 μg/ml，2.5 μg/ml)、5-Fu(200 μg/ml，100 μg/ml，50 μg/ml)和順鉑(10 μg/ml，5 μg/ml，2.5 μg/ml)作用24 h或48 h，然后每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h; 2 500 r/min離板20 min，棄上清，每孔加入200 μl DMSO充分溶解沉淀，10 min內(nèi)于酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長下吸光度。以未轉(zhuǎn)染Decoy-ODN的細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.3 Annexin V/7-AAD雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集轉(zhuǎn)染Decoy-ODN的細(xì)胞接種于12孔板，分別加入阿霉素(5 μg/ml)、5-Fu(100 μg/ml)和順鉑(5 μg/ml)作用24 h;收集細(xì)胞于流式管中，以PBS清洗兩遍，并加入200 μl Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，混勻，每管加入2.5 μl FITC-AnnexinV，4℃避光孵育15min;然后，每管再加入3 μl 7-AAD，4℃避光孵育5 min，最后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以未轉(zhuǎn)染Decoy-ODN的細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療30只BALB/c小鼠進(jìn)行腋下皮下荷瘤，2×106個(gè)H22細(xì)胞/只。一周后，腫瘤可見時(shí)將其隨機(jī)分為五組: control組，PBS治療; 1 mg組，腹腔注射阿霉素1 mg/kg; Decoy+1 mg組，腹腔注射阿霉素1 mg/kg，并且瘤內(nèi)注射Decoy-ODN 100 μl(Decoy-ODN和lipo 2000按照質(zhì)量/體積=1/2溶于PBS中靜置20 min) ; 3 mg組，腹腔注射阿霉素3 mg/kg; Decoy組:瘤內(nèi)注射100 μl Decoy-ODN。給藥時(shí)間: Decoy-ODN給藥時(shí)間為小鼠荷瘤后第7、10、13、16天，阿霉素給藥時(shí)間為小鼠荷瘤后第8、11、14、17天。給藥開始后每2～3 d記錄一次小鼠腫瘤最長直徑a和最短直徑b，腫瘤體積按照公式V=ab2/2計(jì)算。

1.2.5小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群和活化水平檢測(cè)

小鼠荷瘤后第20天尾靜脈取血150 μl，以1 ml紅細(xì)胞裂解液破除紅細(xì)胞，然后加入400 μl PBS懸起細(xì)胞并加入10 μl大鼠血清封閉30 min;將細(xì)胞平分于兩支流式管中，其中一管加入抗DX5、CD107a、CD3e和CD69抗體各0.5 μl，混勻，4℃避光放置1 h;然后，PBS洗一遍并加入100 μl PBS懸起細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。另一管加入抗DX5和CD3e抗體各0.5 μl，混勻，4℃避光放置1 h;然后，PBS洗一遍并加入1%多聚甲醛100 μl，混勻，4℃放置30 min; PBS洗一遍后加入100 μl穿膜液和10 μl大鼠血清封閉30 min，再加入抗IFN-γ和TNF-α抗體各0.5 μl，混勻，4℃避光放置1 h; PBS洗一遍后加入100 μl PBS懸起細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。所得流式數(shù)據(jù)采用FCS Express V3軟件進(jìn)行分析。

1.2.6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的獲取取健康BALB/ c小鼠，無菌取脾臟，剪碎后通過200目篩網(wǎng)研磨過濾，于1 200 r/min離心10 min，棄上清，加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后于4℃放置10 min; PBS洗兩遍，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.7小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)將1.2.6中所得的細(xì)胞接種于96孔板中，同時(shí)加入PMA(10 ng/ml)和離子霉素(200 ng/ml)，并分別加入阿霉素(10、5、2.5 μg/ml)、5-Fu(200、100、50 μg/ ml)和順鉑(10、5、2.5 μg/ml)作用24 h，同1.2.2中的MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.2.8小鼠脾淋巴細(xì)胞活化檢測(cè)將1.2.6中所得的細(xì)胞接種于12孔板中，分別加阿霉素(10、5、2.5 μg/ml)、5-Fu(200、100、50 μg/ml)和順鉑(10、5、2.5 μg/ml)作用24 h;然后收集細(xì)胞于流式管中，PBS清洗兩遍，加入200 μl PBS懸起細(xì)胞，同1.2.5中的方法進(jìn)行抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.9肝癌細(xì)胞與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)將H22細(xì)胞接種于6孔板中，分別加阿霉素(10、5、2.5 μg/ml)作用24 h，收集細(xì)胞于1 200 r/min離心5 min，棄上清。將1.2.6中所得的小鼠脾淋巴細(xì)胞接種于12孔板，然后將阿霉素處理的H22細(xì)胞按照H22細(xì)胞:淋巴細(xì)胞為1∶20的比例加入到脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中，孵育24 h后收集細(xì)胞，并以

1.2.8中的方法進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)間差異通過t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1阻斷STAT3可以增強(qiáng)阿霉素對(duì)H22細(xì)胞增殖的抑制效果首先利用MTT法檢測(cè)H22細(xì)胞轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后，三種化療藥對(duì)其增殖的影響。從圖1A中可以觀察到，轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后，H22細(xì)胞對(duì)三種化療藥的敏感性均有所增強(qiáng)。但是，與未轉(zhuǎn)染Decoy-ODN組相比，轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后，阿霉素對(duì)H22細(xì)胞的抑制率明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)，而5-Fu和順鉑組則沒有明顯差異(圖1B)。這一結(jié)果提示，阻斷STAT3可以提高H22細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。

2.2阻斷STAT3可以促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡如圖2所示，三種化療藥均能不同程度地誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡;但是，轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后，阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡數(shù)由轉(zhuǎn)染前的(9.14±1.78) %增加到(23.48±2.00) %，而5-Fu和順鉑誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡水平在Decoy-ODN轉(zhuǎn)染組與為轉(zhuǎn)染組之間沒有顯著差異。這一結(jié)果提示，阻斷STAT3可以提高阿霉素誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡的能力。

2.3阻斷STAT3可以提高阿霉素抑制H22在小鼠體內(nèi)的生長為了研究Decoy-ODN與阿霉素聯(lián)合作用是否在體內(nèi)也有效，我們利用BALB/c荷瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)，治療方式見圖3A。結(jié)果顯示，經(jīng)過四次治療后，Decoy-ODN與低劑量阿霉素(1 mg/kg)聯(lián)合治療組的腫瘤增長速度明顯低于control組(P＜0.001)和單獨(dú)阿霉素用藥組(P＜0.01) (見圖3B)，其生存期也明顯長于其他組包括阿霉素高劑量組(3 mg/kg) (圖3C)。同時(shí)，在荷瘤后第20天，各組小鼠的體重如圖3D所示，高劑量組(3 mg)小鼠體重明顯輕于control組(P＜0.01)，而聯(lián)合用藥組與control組相比則沒有顯著性差異(P＞0.05)。這一結(jié)果提示，聯(lián)合用藥在提高腫瘤治療效果的同時(shí)，還可以降低阿霉素對(duì)小鼠的毒副作用。

2.4低劑量阿霉素治療可促進(jìn)小鼠免疫系統(tǒng)的活化在對(duì)小鼠進(jìn)行治療的過程中，我們利用流式技術(shù)分析了小鼠PBMC中細(xì)胞亞群及其活化水平。從圖3A可以看到，阿霉素組治療可以升高小鼠PBMC中T細(xì)胞比例(P＜0.05) ;同時(shí)，低劑量阿霉素組和聯(lián)合用藥組的T細(xì)胞表面活化分子CD69表達(dá)明顯高于control組(P＜0.05) (圖3B) ;與control組相比，雖然各治療組不影響NK細(xì)胞的比例，但是低劑量組和聯(lián)合用藥組的NK細(xì)胞脫顆粒相關(guān)分子CD107a(圖3C)以及胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ(圖3D)的表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05)。這一結(jié)果說明，利用低劑量的阿霉素治療肝癌不僅可以避免其對(duì)免疫細(xì)胞的副作用，并且有利于提高荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的活化。

Note: A.MTT assay for the proliferation of H22 cells after treated with three chemotherapy drugs in different concentrations (24 h) ; B．The comparison of cell proliferation inhibition rate by three chemotherapeutic drugs (24 h)．＊＊.P＜0.001.* .P＜0.01.

圖2　阻斷STAT3可以促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡Fig．2 Blocking STAT3 promotes H22 cell apoptosis induced by doxorubicin

2.5低劑量阿霉素作用于腫瘤細(xì)胞后有利于免疫系統(tǒng)的活化為了探討阿霉素對(duì)免疫系統(tǒng)活化的機(jī)制，我們首先檢測(cè)了阿霉素對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響。如圖5A所示，阿霉素和5-Fu對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P＜0.001)，順鉑對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖則沒有明顯影響;同時(shí)，阿霉素處理脾淋巴細(xì)胞24 h后，T細(xì)胞(CD3+DX5－)表面活化分子CD69的表達(dá)隨著阿霉素劑量的增高而降低(圖5B)，表明阿霉素本身對(duì)淋巴細(xì)胞活化發(fā)揮抑制作用。接下來，我們用阿霉素預(yù)先處理24 h的H22細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量阿霉素處理的H22細(xì)胞可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞比例升高，但對(duì)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化沒有顯著影響(結(jié)果未顯示) ;而高劑量阿霉素(10 μg/ml)處理的H22細(xì)胞則對(duì)脾淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出抑制作用(圖5C)。這些數(shù)據(jù)表明，低劑量阿霉素通過作用于肝癌細(xì)胞有利于荷瘤小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)的活化，同時(shí)削弱了阿霉素對(duì)免疫系統(tǒng)的直接毒副作用。

圖3　阻斷STAT3可以提高阿霉素抑制H22在小鼠體內(nèi)生長的能力Fig．3 Blocking STAT3 can enhance the inhibitory effect of doxorubicin on H22 growth in vivo

圖4　低劑量阿霉素治療可促進(jìn)小鼠免疫系統(tǒng)的活化Fig．4 Low dose of doxorubicin therapy can promote activation of immune system in mice FACS detect the T cell

圖5　低劑量阿霉素作用于腫瘤細(xì)胞后有利于免疫系統(tǒng)的活化Fig．5 Low dose of doxorubicin is benefit to activation of immune system by acting on tumor cells

3　討論

由于肝癌易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)以及肝臟器官的特殊性，臨床上難以通過手術(shù)切除的方式對(duì)其進(jìn)行治療，因此化療在肝癌的治療中占有重要地位。但是，肝癌并不屬于化療敏感的癌癥，臨床上化療的有效劑量多伴有明顯的毒副作用。為了提高治療效果同時(shí)降低化療藥物的毒副作用，我們利用靶向阻斷STAT3的Decoy ODN與臨床常用肝癌化療藥阿霉素、5-Fu和順鉑聯(lián)和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)阻斷STAT3信號(hào)可以明顯增加肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的化療敏感性，有效抑制H22細(xì)胞體外增殖能力，誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，二者聯(lián)用后小鼠腫瘤增長速度明顯減慢，且荷瘤小鼠生存期延長。

對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷是化療的突出毒副作用之一。多數(shù)化療藥對(duì)免疫系統(tǒng)有抑制作用，因此有些化療藥物如環(huán)磷酰胺可作為免疫抑制劑應(yīng)用于自身性疾病的治療［11］。另外，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，細(xì)胞毒藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡大多是通過凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的，而凋亡是一種程序性、生理性的過程，即非免疫原性死亡，不會(huì)激發(fā)免疫系統(tǒng)反應(yīng)［12］，這也可能是化療藥誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的原因之一。但是，最近一些研究報(bào)道，化療藥可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，從而激發(fā)免疫應(yīng)答。如5-Fu能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，增加腫瘤相關(guān)抗原的釋放，從而提高DC細(xì)胞的抗原提呈功能［13］。另外，有些化療藥可以直接作用于免疫系統(tǒng)，起到免疫調(diào)節(jié)作用。例如，紫杉醇與小鼠TLR4結(jié)合，通過模擬細(xì)菌LPS作用激活小鼠巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)移的實(shí)體腫瘤患者反復(fù)給予低劑量環(huán)磷酰胺后，宿主Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并且DC細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的敏感性增加［15，16］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)高劑量和低劑量的阿霉素治療荷瘤小鼠后均能增加T細(xì)胞的比例，但是只有低劑量阿霉素和聯(lián)合用藥組才能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化;同時(shí)，低劑量阿霉素和聯(lián)合用藥組促進(jìn)了NK細(xì)胞CD107a和IFN-γ的表達(dá)。進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)證明，阿霉素本身對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖和活化發(fā)揮抑制作用，但是低劑量阿霉素處理的腫瘤細(xì)胞則能促進(jìn)淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)增殖，提示阿霉素可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，從而對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮活化作用，其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證明STAT3信號(hào)通路阻斷與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用，在提高抗腫瘤治療效果的同時(shí)減少化療劑量，從而降低化療藥對(duì)機(jī)體的副作用，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，并且提高了機(jī)體的免疫功能，有利于促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)。因此，合理利用化療藥物的作用機(jī)制，并結(jié)合適當(dāng)?shù)闹委煵呗匀缏?lián)合用藥，將有利于臨床上對(duì)肝癌的協(xié)同治療作用。

參考文獻(xiàn):

［1］Aoki Y，F(xiàn)eldman GM，Tosato G.Inhibition of STAT3 signaling induces apoptosis and decreases survivin expression in primary effusion lymphoma［J］．Blood，2003，101(4) : 1535-1542.

［2］Sun X，Sui Q，Zhang C，et al．Targeting blockage of STAT3 in hepatocellular carcinoma cells augments NK cell functions via reverse hepatocellular carcinoma-induced immune suppression［J］．Mol Cancer Therapeutics，2013，12(12) : 2885-2896.

［3］Dechow TN，Pedranzini L，Leitch A，et al．Requirement of matrix metalloproteinase-9 for the transformation of human mammary epithelial cells by Stat3-C［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2004，101 (29) : 10602-10607.

［4］Haura EB，Turkson J，Jove R.Mechanisms of disease: Insights into the emerging role of signal transducers and activators of transcription in cancer［J］．Nat Clin Pract Oncol，2005，2(6) : 315-324.

［5］Haura EB，Zheng Z，Song L，et al．Activated epidermal growth factor receptor-Stat-3 signaling promotes tumor survival in vivo in non-small cell lung cancer［J］．Clin Cancer Res，2005，11(23) : 8288-8294.

［6］Masuda M，Suzui M，Yasumatu R，et al．Constitutive activation of signal transducers and activators of transcription 3 correlates with cyclin D1 overexpression and may provide a novel prognostic marker in head and neck squamous cell carcinoma［J］．Cancer Res，2002，62(12) : 3351-3355.

［7］Germain D，F(xiàn)rank DA.Targeting the cytoplasmic and nuclear functions of signal transducers and activators of transcription 3 for cancer therapy［J］．Clin Cancer Res，2007，13(19) : 5665-5669.

［8］Yu H，Kortylewski M，Pardoll D.Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT3 in the tumour microenvironment［J］．Nat Rev Immunol，2007，7(1) : 41-51.

［9］Sui Q，Zhang J，Sun X，et al．NK cells are the crucial antitumor mediators when STAT3-mediated immunosuppression is blocked in hepatocellular carcinoma［J］．J Immunol，2014，193 (4 ) : 2016-2023.

［10］Leong PL，Andrews GA，Johnson DE，et al．Targeted inhibition of Stat3 with a decoy oligonucleotide abrogates head and neck cancer cell growth［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2003，100 (7) : 4138-4143.

［11］Schiavoni G，Sistigu A，Valentini M，et al．Cyclophosphamide synergizes with type I interferons through systemic dendritic cell reactivation and induction of immunogenic tumor apoptosis［J］．Cancer Res，2011，71(3) : 768-778.

［12］Bhardwaj N.Harnessing the immune system to treat cancer［J］．J Clin Invest，2007，117(5) : 1130-1136.

［13］Akbulut H，Tang Y，Akbulut KG，et al．Chemotherapy targeted to cancer tissue potentiates antigen-specific immune response induced by vaccine for in vivo antigen loading and activation of dendritic cells［J］．Mol Ther，2008，16(10) : 1753-1760.

［14］Kubo M，Morisaki T，Matsumoto K，et al．Paclitaxel probably enhances cytotoxicity of natural killer cells against breast carcinoma cells by increasing perforin production［J］．Cancer Immunol Immunother，2005，54(5) : 468-476.

［15］Ghiringhelli F，Larmonier N，Schmitt E，et al．CD4+CD25+regulatory T cells suppress tumor immunity but are sensitive to cyclophosphamide which allows immunotherapy of established tumors to be curative［J］．Eur J Immunol，2004，34(2) : 336-344.

［16］Greten TF，Ormandy LA，F(xiàn)ikuart A，et al．Low-dose cyclophosphamide treatment impairs regulatory T cells and unmasks AFP-specific CD4+T-cell responses in patients with advanced HCC［J］．J Immunother，2010，33(2) : 211-218 .

［收稿2015-01-14修回2015-04-03］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．002

通訊作者及指導(dǎo)教師:張建(1965年－)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事免疫藥理與免疫治療學(xué)研究，E-mail: zhangj65@ sdu．edu．cn。

作者簡(jiǎn)介:王亞群(1989年－)，男，主要從事免疫藥理與免疫治療方向的研究，E-mail: wyq890512@ 163．com。

文章編號(hào)1000-484X(2015) 10-1304-07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號(hào)R446.61